枯草芽孢杆菌基因编辑系统优化及GlcNAc合成研究.pdfVIP

摘要

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是一种食品安全级菌株，具有遗传背景清晰、分

子操作技术成熟等优点，是优良的工业生产细胞工厂。目前，在B.subtilis中已经建

立了CRISPR-Cas9基因编辑技术，但仍存在转化率编辑效率不稳定的问题。并且，枯

草芽孢杆菌中缺少多样化的动态调控分子开关。本论文针对以上问题，主要研究内容

如下：

（1）构建CRISPR-Cas9基因编辑系统：选用以甘露糖诱导型启动子Pman控制的

cas9基因和通过强启动子控制的sgRNA编码序列。并对其操作流程进行优化，敲除

效率高达60%。

（2）验证CRISPR-Cas9基因编辑高效性：在B.subtilis中实现了N-乙酰氨基葡

萄糖（GlcNAc）的合成。从四个方面展开：①引入GlcNAc合成途径。在淀粉酶amyE

位点异源表达GlcNAc-6P合成酶基因GNA1，得到菌株S2075摇瓶发酵产量达到1.191

g/L。②阻断GlcNAc降解途径。无痕敲除GlcNAc特异性转运蛋白基因nagP、GlcNAc-

6P脱乙酰酶基因nagA、GlcN-6P脱氨酶基因nagBB，得到菌株S2208摇瓶发酵产量

达到5.696g/L。③强化GlcNAc合成途径。利用CRISPR-Cas9基因编辑系统，在GlcN-

6P合成酶基因glmS前插入强启动子PC2up、乳酸脱氢酶基因ldh位点插入GNA1基因，

得到菌株S2639单位发酵产量达到0.349g/L/OD600。④乙酰辅酶A低碳合成。敲除磷

酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pckA、在murQ位点异源插入来自青春双歧杆菌的磷

酸解酮酶编码基因fxpk，菌株S2757摇瓶发酵产量仅为1.777g/L，分析原因可能是氨

基葡萄糖-6-磷酸和果糖-1,6-二磷酸竞争途径的影响。

（3）构建分子开关并进行效果验证：为了让果糖-6-磷酸更多的进入GlcNAc合

成途径，将构建分子开关，实现磷酸果糖激酶基因pfkA的动态调控，减少果糖-6-磷

酸流向糖酵解途径。在pfkA基因核糖体结合位点插入xylO序列，并引入Pgrac启动子

控制的XylR蛋白，pfkA基因转录水平降低了87%，所得菌株S3053发酵产量达到

5.537g/L，相比对照菌S2757的GlcNAc摇瓶发酵产量提高了3.12倍。

总之，本研究在枯草芽孢杆菌中建立并优化了CRISPR-Cas9基因编辑系统，构建

了分子开关，为枯草芽孢杆菌作为细胞工厂提供高效、可控的基因编辑方法。

关键词：枯草芽孢杆菌；CRISPR-Cas9；分子开关；N-乙酰氨基葡萄糖

ABSTRACT

Bacillussubtilisisafood-safegradestrainwithcleargeneticbackgroundandmature

molecularmanipulationtechnology,whichisanexcellentcellfactoryforindustrialproduc-

tion.Currently,CRISPR-Cas9geneeditingtechnologyhasbeenestablishedinB.subtilis,

butthereisstilltheproblemofunstabletransformationrateeditingefficiency.Moreover,

thereisalackofdiversedynamicregulatorymolecularswitchesinB.subtilis.Thisthesis

addressestheaboveproblemswiththefollowingmainresearch:

(1)ConstructionofCRISPR-Cas9geneeditingsystem:thecas9genecontrolle