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(4)分離及純化酶是生物活性物質，操作條件要溫和，一般在0～5℃間進行。初分：用分離蛋白質的方法，如鹽析、等電點沉澱、有機溶劑分級、選擇性熱變性等方法可從酶粗提液中初步分離酶。細分：再採用吸附層析、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析、疏水層析及高效液相色譜法等層析技術或各種製備電泳技術進一步純化酶，以得到純的酶製品(5)結晶酶的結晶過程進行得很慢，需要數天或數星期。(6)保存通常將純化後的酶溶液經透析除鹽後冷凍乾燥得到酶粉，低溫下可較長時期保存。也可將酶溶液製成25％甘油或50％甘油分別貯於—25℃或—50℃冰箱中保存。注意：酶溶液濃度越低越易變性，因此切記不能保存酶的稀溶液。三、酶分離和純化的注意事項溫度：一般低溫０～１０℃，有些酶耐較高溫度可適當提高溫度，增加溶解度。ＰＨ：一般６～８，遠離酶的等電點攪拌：不可劇烈添加保護劑：防止酶變性失活其他注意事項1.在過濾或攪拌等操作過程中，要防止泡沫的生成，以避免酶蛋白在溶液的表面變性。2.重金屬離子對某些酶的破壞作用，在提取液中加入少量金屬鏊合劑EDTA。3.有些含巰基的酶在分離時，往往需要加入某種巰基試劑，如巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)等，可防止酶的巰基在製備過程中被氧化。4.為了防止內源蛋白酶對酶的水解，在提取液加入少量蛋白酶抑制劑。在酶的製備過程中，每一步驟都應測定留用以及準備棄去部分中所含酶的總活力和比活力，以瞭解經過某一步驟後酶的回收率，純化倍數，從而決定這一步的取捨。總活力=活力單位數／ml酶液×總體積(m1)比活力=活力單位數／mg蛋白(氮)=總活力單位數／總蛋白(氮)mg純化倍數=每次比活力/第一次比活力回收率（產率）=每次總活力/第一次總活力×100%第四節：酶分子的修飾一、目的原因：１．不穩定性２．酶是人體的外源蛋白質，具有抗原性手段：使酶分子結構發生改變，改變酶的某些特性和功能，創造出天然酶不具備的某些優良性狀，使其更適應各方面的需要目的：１．提高酶活力２．改進酶的穩定性３．變化環境中起作用４．改變最適ＰＨ和溫度，改變特異性，催化不同底物５．提高催化過程的反應效率二、酶分子修飾的方法１．金屬離子置換法２．大分子結合修飾３．肽鏈有限水解修飾４．其他修飾方法１．金屬離子置換法通過改變金屬離子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發生改變的方法稱為金屬離子置換修飾如：α－澱粉酶中鎂離子和鋅離子換成鈣離子，可提高酶活力３倍以上方法：１．加入金屬螯合物（如ＥＤＴＡ）２．將金屬離子－ＥＤＴＡ螯合物分離出來３．將不同的金屬離子加入酶液中２．大分子結合修飾利用水溶性大分子與酶結合，使酶的空間結構發生某些精細的改變，從而改變酶的特性與功能的方法目前應用最廣的酶分子修飾方法作用１．提高酶活力：酶的空間結構發生改變，更容易與底物結合，並形成準確地催化部位２．增加酶的穩定性：半衰期，空間結構穩定。１）固定化酶３．降低或消除抗原性３．肽鏈的有限水解修飾某些酶不顯酶活性或酶分子活力不高，利用某些具有高度專一的蛋白酶，對它進行有限的水解修飾，除去一部分肽段或若干個氨基酸殘基作用：１．有利於活性中心與底物結合並形成準確地催化部位，及提高酶活性２．酶活力保持不變，降低抗原性４．其他修飾方法１）對側鏈基團進行修飾，以改變酶的特性和功能２）氨基酸的置換和修飾：將肽鏈上的某一個氨基酸進行置換，從而改變酶的某些特性和功能三．酶分子修飾的注意事項１）修飾劑的選擇２）酶性質的瞭解３）反應條件的選擇第五節酶與細胞固定化一、固定化酶的製備⒈固定化酶的定義：固定化酶是指限制或固定於特定空間位置的酶，具體來說，是指經物理或化學方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發揮催化作用的酶製劑。⒉固定化酶的特點具有生物催化劑的功能，又有固相催化劑的功能。①可多次使用②反應後，酶底物產物易分開，產物中無殘留酶，易純化，產品品質高。③反應條件易控制。④酶的利用效率高。⑤比水溶性酶更適合於多酶反應。⒊酶固定化方法酶和細胞固定化方法載體結合法交聯法包埋法網格型微囊型物理吸附法離子結合法共價結合法熱處理（