DB22-T 1987-2013 饲料中己烯雌酚的测定 液相色谱-质谱-质谱法.docxVIP

DB22T饲料中己烯雌酚的测定液相色谱质谱质谱法

1范围

本标准规定了饲料中己烯雌酚残留量的液相色谱串联质谱测定方法。

本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和预混合饲料中己烯雌酚含量的测定。本方法的检出限为0.5μg/kg，定量限为1.5μg/kg。

2原理

试样中的己烯雌酚经乙腈提取，固相萃取柱净化，采用C18色谱柱分离，以乙腈水溶液为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾离子源（ESI）负离子模式，多反应监测（MRM）模式检测，外标法定量。

3试剂与材料

除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

3.1乙腈：色谱纯。

3.2甲醇：色谱纯。

3.3甲酸：色谱纯。

3.4乙酸铵：色谱纯。

3.5乙腈水溶液（1+1，V/V）：量取100mL乙腈，加入100mL水，混匀。

3.60.1%甲酸水溶液：量取1mL甲酸，加入999mL水，混匀。

3.75mmol/L乙酸铵溶液：称取0.385g乙酸铵，用水溶解并定容至1000mL。

3.8己烯雌酚标准品：纯度≥98.0%。

3.9己烯雌酚标准储备溶液：准确称取10.0mg己烯雌酚标准品，用乙腈溶解并定容至100mL，配制成100μg/mL的标准储备溶液，于18℃避光保存，有效期3个月。

3.10己烯雌酚标准工作溶液：准确吸取适量己烯雌酚标准储备溶液，用乙腈水溶液（1+1，V/V）逐级稀释成浓度为0.5ng/mL、1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL的标准工作溶液，现用现配。

3.11固相萃取柱：HLB固相萃取柱，200mg/6mL，或相当者。

3.12微孔滤膜：0.22μm，有机相。

4仪器与设备

4.1液相色谱串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。

4.2分析天平：感量0.0001g和0.01g。

4.3离心机：转速≥4000r/min。

4.4涡旋混合器。

4.5超声波清洗器。

4.6氮吹仪。

4.7固相萃取装置。

4.8组织匀浆机。

4.9pH计：精度±0.02。

4.10旋转蒸发仪。

4.11具塞离心管：50mL。

4.12容量瓶：10mL、25mL、50mL、100mL。

4.13移液器：10μL、100μL、1000μL、5000μL。

5试样制备与保存

5.1试样制备

取具有代表性的饲料样品约500g，用组织匀浆机充分粉碎混匀，装入洁净容器中，密封备用。

5.2试样保存

6分析步骤

6.1提取

称取5.0g（精确至0.01g）试样于50mL具塞离心管中，加入20mL乙腈，涡旋混合2min，超声提取15min，以4000r/min离心5min。将上清液转移至另一洁净离心管中。残渣再加入20mL乙腈，重复提取一次，合并两次提取液，于40℃水浴中氮吹浓缩至近干。

6.2净化

6.2.1固相萃取柱活化：依次用5mL甲醇、5mL水活化HLB固相萃取柱，保持柱体湿润。

6.2.2上样：将浓缩后的残渣用5mL水溶解，转移至已活化的固相萃取柱中，控制流速不超过1mL/min。

6.2.3淋洗：用5mL水淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液。

6.2.4洗脱：用5mL甲醇洗脱固相萃取柱，收集洗脱液于10mL容量瓶中。

6.2.5定容：用甲醇定容至刻度，混匀，经0.22μm微孔滤膜过滤，供液相色谱串联质谱测定。

7测定

7.1.1色谱柱：C18柱，150mm×2.1mm，3.5μm，或相当者。

7.1.2流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈。

7.1.3梯度洗脱程序：02min，20%B；28min，20%90%B；810min，90%B；1010.1min，90%20%B；10.115min，20%B。

7.1.4流速：0.3mL/min。

7.1.5柱温：30℃。

7.1.6进样量：10μL。

7.2.1离子源：电喷雾离子源（ESI），负离子模式。

7.2.2检测方式：多反应监测（MRM）。

7.2.3毛细管电压：3.0kV。

7.2.4源温度：150℃。

7.2.5脱溶剂气温度：350℃。

7.2.6脱溶剂气流速：800L/h。

7.2.7锥孔气流速：50L/h。

7.2.8己烯雌酚定性离子对、定量离子对及碰撞能量见表1。

表1己烯雌酚的质谱参数

|化合物|母离子(m/z)|子离子(m/z)|碰撞能量(eV)|

|||||

|己烯雌酚|267.1|237.1|20|

||267.1|251.1|15|

7.3定性测定

按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中色谱峰的保留时间与标准工作溶液中己烯