环境微生物生态学学时.pptVIP

不可培养微生物的概念不仅仅局限于VBNC微生物，不可培养是由于受现有纯培养分离技术的限制，目前自然界中绝大部分的微生物是人们还无法纯培养的，甚至是不曾认识的，迄今可培养的微生物仅约占自然界存在微生物的1.0%或更少。它们主要存在于有机物质贫乏的极端环境中，如远洋、深海、贫瘠土壤等环境。一般地，海水中微生物可培养的约为0.001%～0.1%，淡水约为0.25%，土壤约为0.3%，活性污泥为1%～15%左右。（1）微生物不可培养的原因1）寡营养微生物：Kuznetsov等将寡营养微生物定义为可在有机碳含量10mg/L的培养基上生长的微生物。通常情况下，海洋是典型的寡营养环境，溶解性有机碳(DOC)水平常年维持在50μmol/L~100μmol/L或0.6mg/L~1.2mg/L。这些寡营养微生物进化形成了个节约能量的生存策略，它们自由生活在极低水平碳环境中，个体微小，生长缓慢，生长速率和丰度变化很小，以达到最大的营养利用率。这些微小的寡营养细菌有一个高效的营养吸收机制，在低营养浓度下，它们依然可以吸收足够的有机质来维持生长，营养的增加甚至会阻碍其生长。2）协同生长方式的破坏：互养(Syntrophism)和共代谢(Co-metabolism)等方式是微生物在自然界中重要的生存模式之一，共栖、互生与共生等便是微生物自然生态关系中共同协作生存方式的不同层次。同一生境的微生物之间联系千丝万缕，细胞与细胞之间有着广泛的通讯和联系。因此，对微生物而言，纯培养所导致的共同协作的自然生存方式的崩溃是造成其可培养性低的重要生态学原因。3）特殊营养物质的未知或缺乏：纯培养很难提供对许多细菌潜在重要的外源活性物质。比如：在海水或淡水中ATP的浓度可达1nmol/L，很可能源自浮游植物和其它浮游生物；许多水生细菌离不开藻类分泌的生长因子和维生素；植物、动物病原菌对寄主活性物质的依赖等都是传统纯培养法难以提供的。所以，潜在外源活性物质的缺乏也是导致部分微生物难以获得纯培养的重要生态学原因。（1）微生物不可培养的原因4）生长缓慢。5）氧的毒害作用。6）生长条件苛刻。7）样品采集过程的影响。（2）新型微生物分离方法1）菌落转移法：当环境样品转移到固体培养基上时，一些寡营养菌的生长可能会有一个延迟期，在此期间，这些菌可能会被其他快速生长的菌落所掩盖，如一些可以在平板表面滑动和快速分散的细菌。菌落转移法是将平板上新形成的菌落不断地转移到新的培养基上，通过长时间的培养使那些生长较缓慢的寡营养菌得到生长和分离的机会。2）极端稀释法：极端稀释培养是将环境微生物样品不断稀释，使最后一个稀释度中的细胞含量极低(1~10个细胞），其培养液中的营养物浓度一般也很低，最大程度的模拟自然条件下的寡营养状态，会使用未加改动的环境水体作为稀释液和培养液。这种培养方法倾向于选择丰度最大而不是营养感应与耐受性最强的微生物，也就是说，不是最容易培养的，而是自然环境中数量上占有优势的种群。在这种菌群和营养都极端稀释的条件下，数量较多、生长缓慢的海洋寡营养菌的培养占优势。3）扩散培养室及单细胞封装培养：扩散培养室两端用0.03μm微孔滤膜封闭，样品稀释后与自然海水琼脂培养基混合倒入培养室，然后整体置于类似于自然水体的环境中进行培养。这种培养室限制了微生物细胞的进出，但允许化学物质的交换，提供了环境相同组成的化学成分，微生物可以得到由环境提供的各种营养物质。与扩散培养室法类似,单细胞封装培养同样允许细胞在环境营养浓度条件下生长。这种方法又称凝胶微滴培养,是结合单细胞包埋和流式细胞技术的高通量培养法。左：扩散盒，中间为实验样品与琼脂的混合物，两端用0.03um的聚碳酸酯膜封住；右：原位环境培养。分离芯片法：与标准扩散盒法相比，有更短的扩散距离，使更多细胞能感应外部环境并生长；更容易检测和观察；适合于大规模分离和培养。凝胶微滴培养4）单细胞分离：借助特殊的仪器设备，如:显微操作仪、光学镊子、流式细胞仪等。可对单个细胞进行细微操作将其从微生物群体中分离出来，再对分离出的单细胞进行扩大培养以获得纯培养物或进行单细胞PCR扩增。这样就可以避免由于某些微生物数量少、生长受其他微生物抑制或生长缓慢等因素导致的“不可培养性”。不可培养微生物资源由于未培养微生物无论是其物种类群，还是新陈代谢途径、生理生化反应与产物等，都存在着丰富的新颖性和多样性，因而比以往的可培养微生物具有更为丰富和多样化的、可供人类开发利用的生物资源，蕴藏着丰富的新基因。不可培养微生物的研究开拓了微生物学研究的