目的基因导入受体细胞.pptVIP

DEAE－葡聚糖转染法?二乙胺乙基葡聚糖（DEAE-dextran）一种相对分子质量较大的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA其促进细胞捕获DNA的机理还不清楚，可能是因为葡聚糖与DNA形成复合物而抑制了核酸酶对DNA的作用，也可能是葡聚糖与细胞结合而引发了细胞的内吞作用基本操作过程：一种方法是先使DNA直接同DEAE-dextran混合，形成DNA／DEAE-dextran复合物后，再用来处理细胞；另一种方法是受体细胞先用DEAE—dextran溶液预处理，然后再用来与转染的DNA接触。DEAE-dextran与磷酸钙转染法比较有3点不同：①它一般用于基因的瞬时表达，不易形成稳定转化细胞系；②它对细胞有毒性作用，所以某些细胞系(如BSCl，CV-1，COS等)用该转染技术时转染效率很高，而其他类型的细胞则效果较差；③DEAE-dextran可用于转染少量DNA。影响DEAE-dextran转染效率的因素：DEAE-dextran的浓度；DEAE-dextran处理细胞的时间。一般用高浓度(1mg／m1)短时间(30min～1h)；或用低浓度(250ug／m1)长时间(8h)两种方法来进行转染。由于DEAE-dextran对细胞有毒性，所以采用低浓度长时间的方法比较可靠。显微注射转基因技术①理想外源基因的制备。基因可处于质粒上，注射前质粒已经酶切而线性化。有的载体DNA会干扰外源基因的表达，因此注射前，需要先从载体上将它们切下。②收集受精卵。在受孕后的几小时内，父母双方的遗传物质还未结合前，从供体动物中取出单细胞的受精卵。③显微注射。利用极细的毛细玻璃管(外径为0.5—1um)，将理想的遗传物质注入受精卵的雄原核。这必须在父母双方遗传物质融合前的4h间歇期内完成。当双亲染色体相遇后，注入的理想基因有可能整合到染色体上。在受精卵中，雄原核是由精子提供的，比雌原核大，所以通常被用于微注射。④在几次细胞分裂后，将带有理想基因的受精卵移入母体，使受精卵孕育。?a．用此法可向任何类型细胞导入外源基因b．DNA用量极少，每个细胞仅需10-11m1的注射体积；c．注入细胞的DNA分子数可加以控制；d．外源DNA整合到寄主细胞染色体组中的效率可达50％～100％，获得稳定转化系的比例也可达20％。此法的缺点是，其设备要求高，且很昂贵。优点：显微注射法制备转基因小鼠的程序转基因动物的应用基因工程育种；将动物乳腺作为生物反应器，生产对人类有价值的产品，特别是一些药用蛋白（凝血因子VIII、人a抗胰蛋白酶、）采用人为的方法改变动物的基因组组成，以获得各类疾病模型；携带人血清白蛋白基因的转基因试管牛乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊一对毛色光亮的双胞胎克隆牛犊在河北省唐山市芦台经济技术开发区新花奶牛场降生。专家介绍说，因其体内导入了人乳铁蛋白转基因，这两头牛犊长大后，所产牛奶将含有人奶的成分，具有极高的营养价值。这两头牛犊的降生，同时也标志着我国转基因克隆奶牛生产又取得重大进展。2003年美国上市的转红色荧光基因斑马鱼台湾研发成功的全身型转基因斑马鱼2000年10月2日出生的“安迪”是世界上首次培育成功转基因灵长类动物猴相比实验鼠与人更近似，这样我们可以从少量动物身上获得治疗人类疾病更好的答案，同时会加快分子医学的发展速度。2004年7月12日，韩国大邱基督教大学医学院教授金泰完，转GFP基因的鸡第三节重组子的筛选重组子的筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体，获得所需目的重组子的过程重组子：含有重组DNA分子的转化子目的重组子：含有外源目的基因的重组子转化子：导入外源DNA分子后稳定存在的受体细胞。筛选与选择筛选通过某种特定的方法，从受体细胞群体或基因文库中，鉴定出目的重组子的过程。选择通过某种外加压力的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆子的一种方法。选择：转化子的初步筛选筛选：进一步检测目的重组子由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子转化子重组子目的重组子遗传表型直接筛选法依赖于重组子结构特征分析的筛选法核酸分子杂交检测法免疫化学检测法DNA－蛋白质筛选法DNA序列测定法重组子的筛选遗传表型直接筛选法一、根据载体选择标记初步筛选转化子插入失活筛选法插入表达筛选法显色互补筛选法插入失活筛选法将外源D