聚丙烯酰胺凝胶电泳.pptVIP

（3）SDS-聚丙烯酰胺凝胶的染色一般未标记的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶分离后是通过染色进行观察，染色可用考马斯亮蓝或银盐进行，而考马斯亮蓝的染色反应相对快速而且直接一些。考马斯亮蓝能够非特异地与蛋白质结合但不能与凝胶结合，使蛋白质在透明的凝胶基质上呈现分离的蓝色条带(Wilson1983)。银染的方法虽然操作起来麻烦，但显然更灵敏一些。在对凝胶电泳分离的蛋白进行检测时，与考马斯亮蓝染色相比，银染能够检测到浓度低接近100倍的蛋白(Switzeretal.1979，Merrlletal.1984)。银染鉴别蛋白质是根据其对银离子还原的差异性，这一还原反应类似于照相过程。考马斯亮蓝的试剂及试剂盒(如LifeTechnologies公司的BluePrintFastPAGEStain)、银染的试剂盒都有市售商品。考马斯亮蓝R-250最初用作蛋白质染色的实验室试剂是在1963年由在澳大利亚国立大学StephenFazekasdeSt.Groth的实验室工作的Robenwebster发明，由于考马斯亮蓝R-250现已成为IroperialChemicalIndustnesPLC公司的商标，在生化试剂目录中这种染料一般是称作亮蓝(BrilliantBlue)。有亮蓝G和亮蓝R两种形式，在颜色索引(Colourlndex)中给出了不同的编号(42655和42660)。亮蓝G和亮蓝R在冷水中分别为微溶和不溶，在热水和乙醇中分别为可溶和微溶。两种染料均能对经过固定的蛋白有效地进行染色，使用浓度为溶于甲醇：冰醋酸：水(50:10:40，v/v)的0.05%溶液。考马斯亮蓝是一种氨基三苯甲烷染料，可与蛋白质形成较强的非共价复合物，复合物的形成可能是范德华力及与NH3基团的静电作用两种作用的结果。考马斯亮蓝用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质的染色，蛋白质对染料的吸附与蛋白质的量大致成正比，符合比尔—朗勃定律。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶分离的多肽可同时用甲醇:冰醋酸:水固定并用考马斯亮蓝R-250染色，这种三苯甲烷纺织染料又称为酸蓝83。将凝胶浸泡在该染料的甲醇:乙酸浓溶液中数小时，再经长时间脱色将凝胶中过量的染料扩散出去。(4)脱色后保存，将凝胶保存在水中，封存在塑料袋内。凝胶可无限期保存，而染色强度不会降低。但固定的聚丙烯酰胺凝胶在水中保存时会溶涨，保存期间会发生变形。为避免这个问题，可将凝胶存放在含20％甘油的水中。染色的凝胶不要在脱色液中保存，否则会使染色的蛋白条带褪色。(5)作为永久记录，可对凝胶进行拍照或制成干胶。§4.3.7聚丙烯酰胺等电聚焦电泳等电聚焦（isoelectricfocusing，IEF）是一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术，于60年代中期问世。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。1.等电聚焦的基本原理等电聚焦的分离原理是在介质中通过加入两性电解质形成一个pH梯度，两性物质在电泳过程中会被集中在与其等电点相等的pH区域内，从而得到分离。在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH逐渐增大。蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pI）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们在等电点上聚焦为止。可见，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。2.pH梯度的组成pH梯度的组成方式有二种，一种是人工pH梯度，由于其不稳定，重复性差，现已不再使用。另一种是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物，在正极端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在负极端引入碱液，如氢氧化钠、氨水等。电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH相等，用pH0表示。电泳开始后，混合物中pH最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，甚至接近或稍低于pI1，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。由于两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。pH