用盐酸胍裂解细胞.pptVIP

哺乳动物基因组DNA1,6.?DNA/HindIII;2,3.大鼠基因组DNA；4,5.小鼠基因组DNA基因组DNA的检测细菌基因组DNA1.1KbPlusDNALadder;2,3.M.sm基因组DNA123123456讨论细菌基因组DNA的提取磁珠法DNA提取其原理是磁珠表面带有特定活性基团，在特定的条件下能够与目的物质进行特异性结合，同时利用磁珠自身的磁性，在外磁场的作用下可以方便的实现定向移动与富集，进而实现对目标物质的分离纯化。适用于不同的标本类型及标本量。如全血、血浆、咽拭子、组织、痰、脑脊液等生物标本。RNA的提取每个细胞的RNA量约为5~10μg。RNA可分为：80%-85%rRNA（核糖体RNA）、10%-15%tRNA、1%-5%mRNA、前体RNA；其它RNA：hnRNA（不均一核RNA）、snRNA、snoRNA…等RNA的提取在操作程序上虽然与DNA的提取大致相同，但由于RNA极易被RNA酶降解。RNase除胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中。RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，RNase的活性又可恢复。Rnase不需要二价阳离子激活。因此在具体操作上有许多需要特别注意的地方，而去除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。内源性RNA酶外源性RNA酶主要来源：被污染的缓冲液细菌或微生物污染，高压不能去除RNA酶，必须丢弃自动移液装置制备RNA时，最重要的是使RNase灭活：所有容器都要经过高温处理，不能高温高压的用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。设置专门RNA移液、电泳装置。所用化学试剂为RNasefree的。加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活；在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin)变性剂(denaturant)选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂，最强的是异硫氰酸胍和盐酸胍，使蛋白质转换成随机卷曲状态。）使用蛋白酶使用阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠RNA酶变性剂和抑制剂RNA酶抑制剂(RNaseinhibitor)DEPC（焦碳酸二乙酯）高度活化的烷基化试剂，破坏RNA酶活性。用来灭活缓冲液或器皿中的RNA酶。DEPC非选择性的修饰蛋白质和RNA，且与一些缓冲液不相容，故在分离和纯化RNA的过程中不使用DEPC。RNA酶的蛋白抑制剂，该类蛋白质可与RNA酶结合形成非共价复合物从而抑制RNA酶活。商品化的RNA酶蛋白抑制剂的名称各异（如RNAsin等）。联合使用RNase的特异抑制剂（如DEPC与RNasin等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解。注意：DEPC是潜在的致癌剂，须小心操作。还原剂加入β-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法首先以含异硫氰酸胍、β-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的变性溶液裂解细胞。然后在pH4.0的条件下，酚/氯仿抽提细胞裂解溶液。最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总RNA。在酸性条件下，加入氯仿后，DNA未能进入水相，而RNA在水相，离心吸取上清RNA，就去除了DNA。当然也可用RNAsefree的DNase处理。本法具有简便、快速、经济、高效及提取的RNA质量高等优点。商品化的单相裂解试剂法分RNA本法是异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的改进方案。以异硫氰酸胍-酚的单相裂解液裂解细胞，再加入氯仿后形成两相。变性的DNA与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来。保留于上层水相的RNA，通过异丙醇沉淀与75%乙醇洗涤而制备。TRIzol试剂(Invitrogen公司)的主要成分为异硫氰酸胍、?-巯基乙醇、十二烷基肌氨酸钠和苯酚。用TRIzol试剂处理细胞或匀浆组织氯仿萃取蛋白质沉淀RNA洗涤RNA沉淀用RNase-freeddH2O溶解RNA，并置-20?C保存检测RNA(加５?lRNA到１%琼脂糖凝胶中)用TRIzol试剂制备总RNA?为防止单链RNA形成空间结构，需用变性的琼脂糖凝胶即甲醛-琼脂糖凝胶分离R