第六章.重组DNA技术.pptVIP

第6章重组DNA技术及其应用1

一、重组DNA技术概述1.重组DNA技术的相关概念克隆:作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系。作动词时是指基因的分离与重组过程。重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。2

一、重组DNA技术概述2.重组DNA技术的基础DNA的双螺旋结构、遗传信息传递的中心法则、遗传密码，为基因工程奠定了理论基础酶学、细菌学、病毒学的发展，为基因工程提供了必要的工具两项关键性技术（DNA的体外切割与连接技术；DNA的核酸序列分析技术）的问世，从根本上解决了DNA的结构分析问题3

二、重组DNA技术的基本步骤（1）获得目的基因（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传（4）对转化子筛选和鉴定（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物4

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二、重组DNA技术的基本步骤1.目的基因的获取已知基因的获取：PCR、化学合成法未知基因的获取：基因文库分离法、直接分离法6

PCR：polymerasechainreaction，在体外模拟细胞内进行的DNA复制过程二、重组DNA技术的基本步骤1.目的基因的获取之PCR法（1）变性（denaturation）：模板DNA经热变性，双链被解开，成为两条单链。（2）退火（annealing）：温度下降，变性DNA复性，使寡核苷酸引物即与模板DNA中所要扩增序列两端的碱基配对。（3）延伸（extension）：在适宜条件下（包括DNA聚合酶和核苷酸单体），引物3?端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。7

PCR的基本原理1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃8

PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始11

PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq12

PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束13

PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数14

二、重组DNA技术的基本步骤1.目的基因的获取之PCR法特点：灵敏度高；简便、快速；对标本的纯度要求低；需要知道目的基因的全部序列或两端序列。PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定，引物的好坏往往是PCR成败的关键。15

二、重组DNA技术的基本步骤2.目的基因的获取之基因文库分离法基因文库：又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。根据构建方法或材料来源的不同，基因文库分为：基因组文库（含有全部基因）cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）16

二、重组DNA技术的基本步骤2.目的基因的获取之基因文库分离法基因文库的构建17

二、重组DNA技术的基本步骤2.目的基因的获取之基因文库分离法基因特异性：常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息时空特异性：不同代谢阶段（或发育阶段）的基因表达谱不相同；不同器官或组织中基因的表达也不相同不均匀性：在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的各cDNA均可获得表达：一般选用的载体都是表达型的cDNA文库的特点：18

相对于cDNA文库，基因组文库的优点：cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列；cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，分离基因困难；从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。2.目的基因的获取之基