第二章微生物的纯培养和显微技术.pptVIP

第二章

微生物的纯培养及显微技术;一、无菌技术;二、用固体培养基分离纯培养;分离方法;1、平板划线分离法（StreakPlate）;连续划线;平板划线分离图

;平板涂布分离法（SpreadPlate）;十倍稀释图;经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物.

这种方法适合于细胞较大的微生物.;四、显微单细胞（单孢子）分离法;五、选择性培养分离法;厌氧微生物分离方法;②化学方法

A．化学吸氧法——利用化学反应耗氧达到形成厌氧环境的目的。

⑴用焦性没食子酸（1g）与NaOH（10%）反应除氧（100ml空气中的O2）。

⑵密闭容器中利用硫磺或磷的燃烧耗氧形成厌氧环境

⑶NaHSO3+NaCO3混和反应耗氧

B．培养基预还原法

培养基中加入还原剂（半胱氨酸、Na2SVc）再隔绝空气培养，适于培养专性厌氧菌。

③生物方法与需氧微生物共同培养

;;（一）菌种的衰退与复壮的概念

1.衰退（degeneration）：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。

衰退的原因：①基因突变，②分离现象。

常见的衰退现象：

菌落和细胞形态的改变；

生长速度缓慢，产孢子越来越少；

抵抗力、抗不良环境能力减弱等。

代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；;2、菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种

菌种的复壮措施：

①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。

②通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillusthuringiensis的复壮）；

③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。

④采用有效的菌种保藏方法。;3、防止菌种衰退的方法：

①控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-8~10-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）；

②选择合适的培养条件；

③采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）；

④采用有效的菌种保藏方法。;（二）菌种保藏：

1.原理：挑选优良菌种，人工创造低温、干燥、缺氧的环境条件，使微生物菌种的代谢活动处于最不活跃的休眠状态以达保持纯种的目的。

2.目的：

①存活，不丢失，不污染

②防止优良性状丧失

③随时为生产、科研提供优良菌种

;3、方法：

①斜面低温保藏法

原理：低温

方法：将菌种接种在新鲜斜面培养基上?适温培养至生长完全?4℃冰箱保藏?每隔一段时间移接一次

说明：①适于生产和科研中经常采用的菌种；

②保藏时间：霉4个月酵4—6个月

放3个月细1—2个月

③培养基应少含或不含糖分（尤以细菌）

④试管密封以隔绝空气

优：方法简单，成活率高

缺：保存时间短，传代次数多，易变异。

;②石蜡油封藏法

原理：低温、缺氧

方法：将无菌石蜡油注入生长良好的斜面种试管内（油量高出斜面1cm）?包扎后竖直放入冰箱保藏。

说明：①液体石蜡于170℃干热灭菌1h。

②斜面培养基能干燥则保藏效果好。

③保藏时间1—2年。

④适于保藏霉菌、酵母、放线菌及芽孢杆菌。

⑤能同化烃类的微生物不宜用此法。;③砂土管保藏法

原理：干燥、缺氧

方法：取河砂若干，24目过筛?10%HCl浸泡24h?水洗至中性?烘干后分装安瓿瓶或试管，加棉塞?1kg/cm、23分钟?无菌检查?每管加孢子悬液，接种环拌匀?干燥器中干燥?火焰熔封或蜡封?干燥器中保藏

说明：①适于保藏霉菌和放线菌孢子及芽孢杆菌

②时间2—10年;④真空冷冻干燥法

原理：低温、干燥、真空（缺氧）

方法：将菌种用保护剂制成菌悬液，先在极低温度下快速冷冻，再在极低的温度下抽真空干燥，使其中的水分直接升华为水蒸汽，以达干燥的目的。

常用的细胞保护剂：血清、脱脂牛奶、淀粉、葡聚糖

说明：①目前最有效的保藏方法。

②适于细、放、酵、霉、病毒的保存