团体标准 大黄鱼5种细菌性病原快速检测 环介导等温扩增微流控芯片法.docxVIP

团体标准大黄鱼5种细菌性病原快速检测环介导等温扩增微流控芯片法

1范围

本文件规定了大黄鱼（Larimichthyscrocea）5种常见细菌性病原（副溶血性弧菌、哈维弧菌、迟缓爱德华氏菌、灿烂弧菌、诺卡氏菌）的术语和定义、检测原理、样品采集与保存、检测准备、环介导等温扩增（LAMP）微流控芯片检测操作、结果判定、质量控制及生物安全等内容。

本文件适用于大黄鱼养殖场地、水产苗种场、水产品质量检测机构及农业技术推广部门对大黄鱼细菌性病原的临床筛查、快速检测及流行病学调查，涵盖稚鱼、幼鱼、成鱼各生长阶段，也适用于养殖环境及投喂饲料中目标病原的辅助检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB11607渔业水质标准

GB/T18654.1养殖鱼类种质检验第1部分：抽样方法

GB/T27634水生动物疫病实验室检测质量控制规范

NY/T718水生动物产地检疫规范

NY/T1671水生动物病毒学检测采样与保存技术规范

SN/T1151.1水生动物检疫抽样规范第1部分：鱼类

SC/T7021水生动物病原微生物检测环介导等温扩增（LAMP）法通则

SC/T7016.1鱼类病毒核酸检测第1部分：核酸提取方法

YY/T1459微生物检测用核酸扩增微流控芯片通用技术要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

环介导等温扩增（LAMP）：一种基于特异性引物设计，在等温条件下（60~65℃）通过DNA聚合酶催化实现核酸高效扩增的技术，扩增产物可通过荧光信号或显色反应直接判定结果，具有特异性强、扩增效率高、无需复杂仪器的特点。

微流控芯片：集成微通道、反应腔室等结构的微型器件，可实现样品预处理、核酸扩增、结果检测等步骤的集成化操作，单次可同时完成多种病原的平行检测，显著缩短检测时间。

目标病原：本文件特指大黄鱼养殖中高发的5种细菌性病原，包括副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、哈维弧菌（Vibrioharveyi）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiellatarda）、灿烂弧菌（Vibriosplendidus）、诺卡氏菌（Nocardiaspp.）。

阳性对照：含目标病原特异性核酸片段或活体病原的对照样品，用于验证检测体系的有效性和准确性。

阴性对照：不含目标病原及同源核酸的样品（如健康大黄鱼组织匀浆或无菌生理盐水），用于排查污染及假阳性结果。

检出限：本方法对每种目标病原的最低检测浓度，用于界定方法的灵敏度，确保对低浓度感染样品的有效检出。

4检测原理

针对5种目标病原的特异性基因（如副溶血性弧菌toxR基因、哈维弧菌luxR基因、迟缓爱德华氏菌eae基因、灿烂弧菌16SrRNA基因、诺卡氏菌hsp65基因）设计特异性LAMP引物组（包括内外引物、环引物），并将引物、LAMP反应液、荧光染料分别预装于微流控芯片的反应腔室中。

样品经核酸提取后，将模板核酸加入芯片进样口，通过芯片微通道将样品分配至各反应腔室。在等温条件下，若样品中存在目标病原核酸，引物与模板特异性结合并启动LAMP扩增反应，扩增过程中产生的荧光信号被芯片检测系统捕获；若无目标病原核酸，则无扩增反应及荧光信号产生。通过荧光信号有无及对应的腔室位置，实现5种病原的快速定性检测。

5样品采集与保存

5.1采样原则

采样应遵循随机性、代表性原则，参照GB/T18654.1、SN/T1151.1执行。发病场地采样需覆盖不同生长阶段、不同发病程度（发病个体、疑似感染个体、健康个体）的大黄鱼，每批次采样数量：稚鱼、幼鱼10~15尾，成鱼5~8尾；同时采集养殖水体、底泥及投喂饲料样品，每份样品标注采样时间、地点、样品类型、生长阶段及养殖密度等信息。

5.2采样方法

活体样品：选取发病及疑似发病大黄鱼，无菌操作下采集肝、脾、肾、鳃及病灶组织（如皮肤溃疡、肠道病变部位）各0.3~0.5g，放入无菌离心管；同时用无菌棉签擦拭体表黏液，或将鳃丝剪下放入无菌容器中。健康大黄鱼采样部位及方法同上，作为现场对照。

死亡样品：选取新鲜死亡（死亡时间不超过2h）个体，无菌采集肝、脾、肾、鳃及病变组织，每份样品0.5g，放入无菌离心管，记录死亡时间及体表症状。

环境样品：采集养殖水体500mL/份，装入无菌采样瓶，加入无菌甘油（终浓度10%）；采集底泥200g/份，装入无菌密封袋；采集投喂饲料100g/份，装入无菌密封袋，标注投喂时间及来源。

5.3样品保存与运输

样品采集后立即置于4℃冷藏（保存不超过24h）或-20℃冷冻（短期保存，不超过72h），长期保存需