利用杆状病毒系统生产携带抗体表达基因的双链AAV的研究.docVIP

  利用杆状病毒系统生产携带抗体表达基因 的双链 AAV 的研究# 刘海燕1,2，钱其军1,2** 5 10 15 20 25 30 35 40 （1. 浙江理工大学生命科学学院新元医学与生物技术研究所，杭州 310018； 2. 第二军医大学东方肝胆医院病毒基因治疗实验室，上海 200438） 摘要：目的：利用杆状病毒系统生产表达抗体的 8 型双链 AAV，并于体外初步检测病毒的 生 产 能 力 及 病 毒 活 性 。 方 法 ： 首 先 利 用 杆 状 病 毒 系 统 生 产 出 ssrAAV8-EGFP 以 及 scrAAV8-EGFP，体外检测两者绿色荧光表达的区别。然后利用杆状病毒系统生产出 scrAAV8-AT7，实时荧光定量 PCR 测其滴度，感染 HEK293 细胞后检测抗体的表达情况。 结果：绿色荧光蛋白皆成功表达，通过表达出的荧光可见 scrAAV8-EGFP 具有明显的优势。 实时荧光定量 PCR 检测结果表明 100 ml 摇瓶中 scrAAV8-AT7 的病毒量可达 1.41×1013 VG， 蛋白印迹法检测出阿瓦斯汀（Avastin）重轻链已成功表达，ELISA 检测出 Avastin 在体外 的表达量可达 770 ng/ml。结论：本课题已初步探索出利用杆状病毒系统来生产表达 Avastin 的双链 AAV 的方法，且生产出的病毒具有生物学活性并能实现外源基因的体外表达。 关键词：杆状病毒；双链 AAV； Avastin；病毒生产 中图分类号：Q782 Production study of scAAV with antibody expressing gene using the baculovirus system LIU HaiYan1,2, QIAN QiJun1,2 (1. Xinyuan Institute of Medicine and Biotechnology,School of Life Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, Zhejiang, China; 2. Laboratory of Virus and Gene Therapy, Eastern Hepatobiliary Surgical Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438, China) Abstract: Objective: To build recombinant self-complementary adeno-associated virus serotype 8 with antibody expressing gene using the baculovirus system, and preliminarily test the infection viability of produced virues in vitro. Methods: This study producted ssrAAV8-EGFP and scrAAV8-EGFP using the two baculovirus system, and detected the expression of the fluorescent displayed firstly. Then this experiment producted scrAAV8-AT7, the titer was determined by real-time quantitative PCR. Using HEK293 cells to detect the expression of antibody (Avastin). Results: Both viruses expressed the fluorescent successfully, the expression of the fluorescent displayed that scrAAV8-EGFP had obvious advantages. Real-time PCR showed there are 1.41×1013 VG/bottle (100 ml), Western blot showed that light and heavy chains of Avastin were expressed, successfully; ELISA showed the expression of Avastin was up to 770 ng/ml in vitro. Conclusion: This stud