谷氨酸棒杆菌YILW 苏氨酸脱水酶基因的克隆表达及酶学性质.pdfVIP

第９卷第１期 生　物　加　工　过　程 Ｖｏｌ．９Ｎｏ．１ ２０１１年１月 ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊａｎ．２０１１ 11 1 ｄｏｉ： １０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０１．０１２ 谷氨酸棒杆菌ＹＩＬＷ苏氨酸脱水酶基因的 克隆表达及酶学性质 史建明，徐兰兰，徐庆阳，谢希贤，陈　宁 （天津科技大学 生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室，天津 ３００４５７） 摘　要：将 Ｌ 异亮氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌（ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＹＩＬＷ）苏氨酸脱水酶（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｄｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ，ＴＤ）的编码基因ｉｌｖＡ在大肠杆菌中进行异源表达及进行初步的酶学性质研究。分别以 Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、ＹＩＬＷ的基因组ＤＮＡ为模板，利用ＰＣＲ技术扩增出苏氨酸脱水酶的编码基因 ｉｌｖＡ，测序获得编码序 列。利用质粒ＰＥＴＨｉｓ将该基因在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行重组表达、金属螯合纯化，对其酶学性质进行初步 研究。结果显示Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＹＩＬＷ编码基因序列与已报道的ｉｌｖＡ序列相差５个碱基，相似度为９９６％，第３８３ 位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸。酶学性质研究表明：重组酶ＹｉｌｗＴＤ最适反应温度为３２℃，在２０～５５℃范围 内该酶较稳定，最适ｐＨ为６７，该酶底物专一性强，对最适底物苏氨酸的米氏常数Ｋ ＝８３２ｍｍｏｌ／Ｌ，最大反应速 ｍ 度Ｖ ４ ｍａｘ＝３１８×１０Ｕ／ｍｇ，与野生型酶相比，突变（Ｆ３８３Ｖ）后可显著降低终产物对酶的反馈抑制作用。为揭示突变 对苏氨酸脱水酶活性的影响及进一步利用基因工程技术改造Ｌ 异亮氨酸生产菌，提高Ｌ 异亮氨酸产量奠定了 基础。 关键词：谷氨酸棒杆菌；酶学性质；表达；苏氨酸脱水酶 中图分类号：Ｑ８１２；Ｑ７８　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０１－００５５－０６ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｒｅｏｎｉｎｅｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ ｆｒｏｍＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＹＩＬＷ ＳＨＩＪｉａｎｍｉｎｇ，ＸＵＬａｎｌａｎ，ＸＵＱｉｎｇｙａｎｇ，ＸＩＥＸｉｘｉａｎ，ＣＨＥＮＮｉｎｇ （ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＴｉａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎｇ３００４５７，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｔｈｒｅｏｎｉｎｅｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅｇｅｎｅｉｌｖＡｆｒｏｍＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＹＩＬＷｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｗｅｒｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ．ＴｈｅｔｗｏｉｌｖＡｇｅｎｅｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅ Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＹＩＬＷａｎｄＡＴＣＣ１３０３２ｇｅｎｏｍｅｂｙＰＣＲｗｉｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓ，ｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｔ Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｂｙｕｓｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴＨｉｓ．Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｈｒｅｏｎｉｎｅｄｅｈｙｄｒａｔｅｓｅｎｚｙｍｅｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｍｅｔａｌｃｈｅｌａ