人类脐血间充质干细胞移植对急性肝坏死大鼠模型治疗作用的研究.pdfVIP

摘要 目的 建立并优化人类脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCBMSCs)的培养体系和体外标记、体内示踪体系； 观察绿色荧光蛋白标记的人类脐血间充质干细胞移植给急性肝坏死大鼠模型后， 移植细胞的体内迁徙途径、分化命运及间充质干细胞对急性肝坏死大鼠模型的治 疗作用。 方法 密度梯度离心、贴壁培养法分离人类脐血间充质干细胞，低血清/富含血清 两种培养基培养间充质干细胞，单一人份/三人份混合两种方式培养人类脐血间 充质干细胞。慢病毒为载体转染绿色荧光蛋白基因至人类脐血间充质干细胞做体 外标记。标记的 hUCBMSCs 肝脏局部注射移植给模型大鼠，CCl4 腹腔注射制造急 性肝坏死模型；统计组间存活率差异探讨间充质干细胞移植对急性肝坏死大鼠模 型的治疗作用；移植后 48h、72h、1w、2w、4w 取模型大鼠肝组织做冰冻切片， 荧光显微镜下观察中 GFP-hUCBMSCs 的迁徙途径；免疫组织化学和实时荧光 RT-PCR检测移植细胞的分化和存活命运。 结果 富含血清培养基和混合培养有利于人类脐血间充质干细胞的生长。绿色荧 光蛋白转染细胞荧光显微镜下呈现均一绿色荧光影像。hUCBMSCs 移植治疗急性 肝坏死大鼠模型的存活期显著延长。移植治疗组48h存活率与对照组的差异有统 计学意义。细胞移植给急性肝坏死模型鼠 24h 内可见荧光信号由进针孔迁徙至汇 管区，移植治疗48h时移植细胞定居于汇管区，48h 后荧光信号向坏死病灶区域 迁徙，1w 后一定数量的移植细胞在坏死区域弥散定居，4w 后未见荧光信号明显 衰弱。细胞移植给生理盐水模拟造模组 24h 内可见荧光信号由进针孔迁徙至汇管 区，移植治疗48h时移植细胞定居于汇管区，48h 后荧光信号随机弥散分布，1w 后荧光信号开始减弱，4w 后荧光信号明显衰弱。免疫组织化学检测显示在移植 组模型鼠肝组织中有人类肝细胞特异性AFP、ALB、Hep parⅠ标记蛋白表达。实 时荧光 RT-PCR 分析移植组模型鼠肝组织中存在人类肝细胞特异性 AFP、ALB、 CK18、CK19mRNA基因表达。 I 结论 本研究建立了优化的人类脐血间从质干细胞培养体系和人类脐血间充质 干细胞体外标记、体内示踪体系。移植细胞在模型鼠体内经过“进针孔-汇管区”、 “汇管区-坏死区域”的二次迁徙模式。移植细胞在模型鼠体内呈现肝样细胞表 型。hUCBMSCs 移植可明显延长急性肝坏死大鼠模型存活期。其治疗效果与移植 细胞向病变部位靶向迁徙、定向分化有关，也与免疫调节和细胞融合等机制相关。 关键词：人类脐血间充质干细胞；培养；移植；分化；靶向迁徙；肝样细胞 II Abstract Objective To establish and optimize the culture system ，markers in vitro ，tracing in vivo system of the human umbilical cord blood mesenchymal stem cells （hUCBMSCs) . To observe the migration and differentiation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells marked with green fluorescent protein （GFP ） after being transplanted into rat model of acute hepatic necrosis. To evaluate the effects of transplantation on the outcome of rat model of acute hepatic necrosis, and probe its underlying mechanism. Method Human umbilical cord blood mesen