特异性抗肝癌单链抗体scFv 4-16靶抗原的筛选、鉴定及意义.pdfVIP

摘要 研究背景和意义：原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC) 是人类最常见 的恶性肿瘤之一，恶性程度高、预后差、死亡率高,全世界每年约有 100 万人死 于肝癌。传统的外科手术和放化疗等治疗手段疗效不理想，尚缺乏特异性的早期 诊断标志物。单链抗体（Single chain variable fragment, scFv）分子质量小、 穿透力强、体内半衰期短、免疫原性低并且具有亲本抗体相同抗原的结合能力， 是肝癌导向治疗较理想的载体。我们课题组采用噬菌体抗体库技术成功地筛选出 1 株特异性抗肝癌scFv 4-16 （GenBank 登录号：DQ640759 ），并对其进行了体 外亲和力成熟及人源化改造，获得了高亲和力人源化抗肝癌scFv HDM 。初步研 究显示特异性抗肝癌scFv 4-16 能与肝癌细胞及肝癌组织抗原特异性结合，具有 较好的开发和临床应用前景。但是，特异性抗肝癌scFv 4-16 的作用位点 （靶抗 ）尚不清楚，作用机制也还有待研究。因此，本研究重点筛选和鉴定特异性抗 肝癌scFv 4-16 识别的靶抗原，明确其作用位点，为肝癌早期诊断、免疫治疗及 肿瘤疫苗研究提供新的思路和方法 第一部分 人肝癌细胞cDNA 噬菌体表达文库构建和鉴定 目的：构建肝癌抗 基因cDNA 噬菌体表达文库。方法： 肝癌细胞提取总RNA， 纯化mRNA，用RT-PCR 反转录合成cDNA 第一链，LD-PCR 合成cDNA 第二链，除去 ＜500bp 小片段，与λTriplEx2 噬菌体载体连接并体外包装，转化大肠感菌 E.coli XL1-blue，测定文库的库容和重组率，PCR 鉴定插入cDNA 片段大小。结 6 果：构建的肝癌抗 基因cDNA 噬菌体表达文库， 始库容为3.4×10 pfu/ml， 重组率为98.2％；文库扩增后库容为9.6×1011 pfu/ml，重组率为97.2％；重 组子插入cDNA 片段大小600bp2kb 不等，平均 1.4kb。结论: 成功构建高质量 的肝癌抗 基因cDNA 噬菌体表达文库，为肝癌特异性抗原的筛选和鉴定奠定了 基础。 第二部分 人源化抗肝癌scFv HDM 的优化表达、纯化及生物学活性鉴定 目的：优化表达人源化抗肝癌 scFv HDM，并鉴定其生物活性。方法：以 ITPG 诱导大肠杆菌HB2151 表达可溶性抗肝癌单链抗体；利用HiTrap Anti-E Tag 亲 I 和层析柱对阳性克隆表达的单链抗体进行纯化；纯化后的单链抗体进行 SDS-聚 丙烯酰胺凝胶电泳，以Bradford 检测法测定其浓度，ELISA 法及免疫组化法鉴 定其生物学活性；结果：在培养基中加入0.4M 蔗糖，以IPTG 1mmol/L 于30℃ 诱导 12h，抗肝癌scFvHDM 可溶性表达量较多，纯化后可溶性抗肝癌 scFv 含量 为325g/L。纯化的抗肝癌scFvHDM 与肝癌组织、肝癌细胞抗原特异性结合，具 有良好的生物学活性。结论：成功获得具有生物活性的人源化抗肝癌scFv HDM。 第三部分 人肝癌细胞cDNA 文库的筛选及阳性克隆分析 目的：筛选并鉴定特异性抗肝癌scFv 4-16 识别的靶抗原。方法：以特异性抗肝 癌scFv 4-16、scFv DM、scFv HDM 为探针筛选cDNA 噬菌体表达文库，并对阳性 克隆进行DNA 序列测定及生物信息学分析，RT-PCR 检测阳性克隆mRNA 在各类细 胞中的表达。结果：经过三轮筛选获得1株阳性克隆 （抗肝癌scFv 4-16G），DNA 序列为833bp，与角蛋白23 有99%的同源性；RT-PCR 检测显示抗肝癌scFv 4-16G 在三种肝癌细胞中表达，在胃癌细胞中弱表达，在L02 胎肝细胞中不表达。结论： 角蛋白23 可能是特异性抗肝癌单链抗体scFv 4-16 识别的靶抗原。 关键词 单链抗体 肝癌 筛选 鉴定 cDNA 文库 肿瘤抗 II Abstract Background Hepatocellula