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姜黄素对 TNF-α损伤的大鼠海马神经元的保护作用及机制 中文摘要 自从1981年发现第一例艾滋病（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS ） 患者至今，科学家和医学工作者针对AIDS和其病原体人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus ，HIV ）做了大量的研究。高效抗逆转录病毒疗法(highly active antiretroviral therapy , HAART)的应用延长了HIV-1感染患者的生命，降低了 患者的死亡率。然而当AIDS患者的死亡率下降后，AIDS患者饱受其他系统并发症 困扰的问题凸显了出来，其中最常见和最严重的并发症之一是中枢神经系统并发 症——艾滋病痴呆综合症（HIV-1 associated dementia, HAD ）。HAD 即认知、运动 或行为损伤，发生于60%以上的AIDS病人中，是引起AIDS患者死亡的主要原因之一。 据报道，HAD已经是60岁以下人群最常见的痴呆类型。然而HAART对HAD的治疗效果 不佳，不能减轻HAD患者脑中的病变程度，患者的临床症状也未得到明显改善。 令研究人员不解的是，HAD患者脑中的病毒载量很低，无法解释神经病变的严 重程度。那么，如此严重的神经元损伤是如何产生的呢？根据最新的研究成果， 虽 然HIV-1及其蛋白gp120、gp41和反式作用因子Tat可以直接对神经元产生毒性损 伤，但是这些病毒蛋白激活巨噬细胞和小胶质细胞释放的细胞因子，如肿瘤坏死 因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 、白细胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)和白细 胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)等引起的脑组织的免疫反应和炎症损伤在HAD的病理 机制中更为重要。其中TNF-α有较大神经毒性，能够刺激星形胶质细胞和小胶质细 胞分泌大量兴奋性神经递质谷氨酸 (glutamate, Glu) ，并抑制星形胶质细胞对Glu 的吸收。细胞外Glu浓度的不断升高造成神经元兴奋性中毒和损伤。 中药单体姜黄素具有抗炎、抗HIV、抗肿瘤等多重药理活性，姜黄素可直接或 间接影响HIV-1长末端重复序列，抑制HIV-1复制所需的蛋白酶和整合酶，干扰病 毒复制。姜黄素还可以抑制TNF-α、IL-1β和IL-8等炎症因子，减轻炎性疾病的症 状。然而将姜黄素运用于HAD的防治国内外尚未见报道。本室以往的研究已证明姜 黄素可以改善gp120所致学习记忆障碍大鼠的行为学功能，提高学习记忆能力。本 实验在此基础上从抗炎角度着重研究了姜黄素对炎症因子TNF-α损伤的大鼠海马 神经元的保护作用及机制，旨在为防治HAD提供有益的实验依据。 I 目的 观察中药单体姜黄素对 TNF-α 损伤的大鼠海马神经元的结构性和功能性保护 作用，并初步探讨姜黄素对 TNF-α 损伤的大鼠海马神经元的结构及功能保护作用 的机制，为姜黄素应用于临床防治HAD 提供重要的实验依据。 方法 1. 大鼠海马原代细胞培养共使用新生24 小时的 Spraugue-Dawley (SD)大鼠 30 只。将大鼠海马神经元分离培养至第 7 天，用免疫组化荧光染色的方法标记神经 元中的 Tau 蛋白，在倒置荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察其形态特征，鉴 定神经元。 2. 经过鉴定的神经元分别与低、中、高浓度的 TNF-α及低、中、高浓度的姜 黄素共同孵育。通过观察神经元形态学变化筛选出 TNF-α的损伤浓度(高浓度，100 ng/mL)及姜黄素的安全浓度(低浓度，1μmol/L) 。 3. 海马神经元培养至第 5 天后分为 4 组：对照组、TNF-α组、姜黄素组和姜 黄素+TNF-α组。对照组培养基中不加药物。TNF-α组培养基中含有 100 ng/mL 的 TNF-α。姜黄素培养基中含有 1μmol/L 的姜黄素。姜黄素+TNF-α组培养基中则同 时含有 1μmol/L 的姜黄素和 100 ng/mL 的 TNF-α。各组药物处理后立刻在倒置显 微镜下进行 1 小时动态延时摄片，48 小时后再进行静态摄片观察神经元生长状况 和形态变化。另一批分组相同的海马神经元培养至第 7 天时再向培养基中加入各 组相应药物，加药后立即