咖啡酸苯乙酯对小鼠免疫功能及脑缺血再灌注损伤的影响.pdfVIP

咖啡酸苯乙酯对小鼠免疫功能及脑缺血再灌注损伤的影响咖啡酸苯乙酯对小鼠免疫功能及脑缺血再灌注损伤的影响 咖啡酸苯乙酯对小鼠免疫功能及脑缺血再灌注损伤的影响咖啡酸苯乙酯对小鼠免疫功能及脑缺血再灌注损伤的影响 硕士研究生硕士研究生：唐先高：唐先高 硕士研究生硕士研究生：：唐先高唐先高 导导 师：师：曾耀英曾耀英 研究员研究员 导导 师师：：曾耀英曾耀英 研究员研究员 暨南大学组织移植与免暨南大学组织移植与免疫实验中心疫实验中心 暨南大学组织移植与免暨南大学组织移植与免疫实验中心疫实验中心 中中 文文 摘摘 要要 中中 文文 摘摘 要要 目的目的： 目的目的 体外研究咖啡酸苯乙酯( Caffeic acid phenethyl ester, CAPE)对小鼠 T 细胞活化、增殖、 细胞周期和凋亡以及胞内 Ca2+浓度的影响，探讨其对小鼠T 细胞免疫功能的作用；研究CAPE 对小鼠腹腔巨噬细胞和 RAW264.7 巨噬细胞系(macrophage, Mφ) 的增殖、吞噬功能以及产生 一氧化氮 （NO ）的影响，探讨其对小鼠固有免疫功能的作用；建立小鼠脑缺血再灌注损伤 模型，初步探讨 CAPE 对脑缺血再灌注损伤小鼠的保护作用。 方法方法： 方法方法 以多克隆刺激剂刀豆蛋白A(concanavalin ，Con A)刺激 T 淋巴细胞活化和增殖，利用荧 光标记的单克隆抗体双染技术结合流式细胞术检测小鼠 T 淋巴细胞 CD69、CD25 的表达情 况；Fluo-4/AM 染色分析细胞内 Ca2+浓度变化情况；CFDA-SE 染色法结合流式细胞术检测 T 淋巴细胞的增殖情况；碘化丙锭( propidium iodide ，PI )染色分析细胞周期分布；Annexin-V/PI 双染法检测 CAPE 对由地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡的影响。MTT 法检测 CAPE 对脂多 糖（LPS ）刺激的Mφ增殖的影响 ；用免疫荧光微球结合流式细胞术检测 CAPE 对 LPS 刺激 的Mφ吞噬功能的影响；Griess 反应试剂盒检测 CAPE 对 LPS 刺激的 Mφ产生 NO 的影响。 通过外科手术对小鼠左右侧颈总动脉进行结扎建立小鼠脑缺血再灌注损伤模型(cerebral ischemia reperfusion injury, CIR/I )，在术前 30mins 给小鼠尾静脉注射不同剂量的 CAPE 。干 湿重法测小鼠脑组织水含量的变化；Griess 反应试剂盒检测小鼠血清中 NO 浓度变化情况； H2DCFDA 染色法结合流式细胞术检测小鼠外周血中性粒细胞胞内反应氧族(reactive oxygen 3 system, ROS )水平变化情况。 结果结果： 结果结果 1．终浓度分别为0.5,1,5, 10 mg/L的CAPE对Con A诱导T细胞表面活化标记分子CD69、 CD25 的表达和细胞内Ca2+浓度有明显的下调作用；CAPE 能有效地抑制经Con A刺激48h和 72h后T细胞的增殖，其中浓度为10 mg/L的CAPE抑制效果最显著；增加处于凋亡峰的细胞数 目，减少处于S期和G2/M期细胞数目；对Dex诱导小鼠胸腺细胞的凋亡起到协同促进作用。 2 ．MTT法检测结果表明，各浓度组的CAPE均能抑制由LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞和 RAW264.7 巨噬细胞系的增殖作用；吞噬实验结果显示，CAPE能促进静息状态下的巨噬细胞 对荧光微球的吞噬作用，但对经LPS活化后的巨噬细胞对荧光微球的吞噬功能起到了明显的 抑制作用；不同浓度的CAPE能有效地下调LPS刺激下的巨噬细胞NO 的水平。 3 ．实验结果显示，与伪手术组相比，手术组的小鼠脑组织含水量明显升高，表明手术 组的小鼠发生了脑水肿，同时血清中NO和中性粒细胞胞内ROS 的水平均明显上升；与手术 组相比，CAPE治疗组小鼠NO 、RO