免疫层析法结合免疫磁分离技术在大肠杆菌检测中的应用.pdfVIP

中 文 摘 要 目的： 大肠杆菌O157:H7已成为威胁人类健康的重要致病菌之一。由于其致病力强、感 染剂量低、潜伏期长，使得对传染源的控制、监测和追踪成为难题。因此，建立快速、简 便、灵敏度高和特异性强的检测方法对于食品安全的筛查、诊断、治疗、监测和控制具有 重要的意义。 方法： 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，通过紫外分光光度计、透射电镜分析和观察 表征和形貌。在胶体金上标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，并测定最小标记浓度和最适 pH值。将纯化后胶体金标记抗体点样在玻璃纤维膜上，以大肠杆菌O157:H7单克隆抗体和 兔抗鼠IgG包被于硝酸纤维膜上，成为检测线(T线)和质控线(C线)，采用双抗体夹心法， 制备成大肠杆菌O157:H7胶体金免疫层析试纸条。对试纸条各项指标进行优化，确定了最 佳抗体包被浓度和金标抗体缓冲液稀释倍数。并对不同浓度的大肠杆菌O157:H7菌悬液进 行检测，观察该方法的灵敏度、特异性、重复性和稳定性。 将胶体金免疫层析法与免疫磁分离技术结合，对大肠杆菌O157:H7进行快速检测。磁 珠包被羊抗鼠IgG再与大肠杆菌O157:H7单克隆抗体偶联，制成免疫磁珠。以该免疫磁珠捕 获富集样本中的大肠杆菌O157:H7，再将富集出来的大肠杆菌O157:H7与免疫磁珠分离，对 分离重悬后的菌悬液进行胶体金免疫层析试纸条的检测，评价富集后检测的灵敏度、特异 性。利用建立的免疫磁性分离与胶体金免疫层析法制备大肠杆菌O157:H7检测试剂盒对150 份模拟食品样本(包括牛奶、纯净水和牛肉)进行检测，并与传统的金标准方法进行比较， 以评价此方法符合率和优缺点。 结果： 成功制备了 20nm的胶体金，平均直径为 20±3nm, 颗粒大小均匀,形状规则，分 散性好。胶体金标记抗体最佳pH值为 8.0，最佳标记蛋白量为16.8μg/ml。胶体金标记抗 体最适稀释度为 1：1，T线为 1mg/ml，C线为 5mg/ml条件下效果最佳，5min左右显示清晰 的条带。用胶体金免疫层析试纸条检测纯大肠杆菌O157:H7 菌悬液时，检测灵敏度为 105CFU/ml，特异性好，稳定性和重复性佳。当胶体金免疫层析试纸条结合免疫磁性分离技 术检测纯大肠杆菌O157:H7 菌悬液时，检测灵敏度可达 103CFU/ml,特异性相似；在模拟食 品样本检测中，与金标准方法检测结果一致，具有较好的吻合度。 结论： 成功研制了大肠杆菌O157:H7胶体金免疫层析试纸条，该试纸条具有灵敏度高、 特异性好、检测速度快、操作简便等优点，可用于现场大量样品的初筛。另外，成功建立 的胶体金免疫层析试纸条结合免疫磁珠分离技术检测大肠杆菌O157:H7方法，检测的灵敏 I 度提高了两个数量级，特异性相似。对于商检、海关、出入境等食品管理的现场筛查、监 控和控制具有重要的社会意义和经济效益。 关键词： 胶体金；免疫磁性微球；大肠杆菌O157:H7 ；免疫层析；试纸条。