人MIP-1α重组腺病毒的构建、表达及其趋化作用的初步 研究.pdfVIP

暨南大学硕士学位 人 MIP-1α 重组腺病毒的构建、表达及其趋化作 用的初步研究 硕士研究生 林长乐 专 业 免疫学 指 导 教 师 曾耀英 研究员 单 位 暨南大学组织移植与免疫中心 中文摘要 目的： 利用Adeasy腺病毒载体系统构建携带人MIP-1α （巨噬细胞炎症蛋白-1α，macrophage + inflammatory protein 1α, MIP-1α）基因的重组腺病毒表达载体，研究MIP-1α蛋白对CD3 、 + + CD4 、CD8 淋巴细胞（lymphocyte ）以及单核细胞（monocyte ）的趋化作用，为对进一步研 究MIP-1α蛋白在免疫系统中的功能和作用机制奠定基础。 方法： 利用携带 MIP-1α基因的 pReceiver-M01-mip 质粒为模板进行 PCR ，将目的基因用 Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ 双酶切后连接到带有 GFP 标记的 pAdTrack-CMV 质粒上。Pme I 线性化 重组质粒 pAdTrack-CMV-mip 后，与腺病毒质粒 pAdeasy-1 共转化 BJ5183 细菌进行同源重 组，获得重组腺病毒表达载体 pAd-mip ，再经Pac I 线性化后转染 HEK-293A 细胞，收获 病毒重组子，TCID50 计算重组腺病毒滴度。Western blot 法和 Flex Set 流式细胞术分别检测 HEK-293A 细胞内和培养上清中 MIP-1α蛋白表达情况。最后通过 Transwell 建立细胞趋化 + + + 模型，结合流式细胞仪绝对计数方法，评估 MIP-1α蛋白对 CD3 、CD4 、CD8 淋巴细胞 以及单核细胞的趋化作用。 结果： 构建了重组腺病毒Ad-mip, 证实了HEK-293A细胞被Ad-mip感染后，能够表达MIP-1α 蛋白并同时能分泌于胞外。Ad-mip感染HEK-293A细胞后，所收集的培养上清与人外周血 I 暨南大学硕士学位 + + + 中的CD3 、CD4 、CD8 淋巴细胞以及单核细胞经过5 h的孵育，相对于空白载体腺病毒 Ad-blank实验组和培养基对照组，各细胞在MIP-1α作用下均发生了明显趋化行为，趋化指 数显著提高（P0.05 ）。但是MIP-1α蛋白对各种细胞的趋化能力并不一致，趋化指数最高 为单核细胞（5.22±0.12 ），同时在所设两个浓度的Ad-mip实验组中单核细胞的趋化指数均 + 比同组其它细胞高（P0.05 ），而在T细胞亚群中，CD4 细胞趋化指数（2.07±0.04, 1.65±0.07 ） + 又要高于同组的CD8 细胞（1.61±0.02, 1.47±0.03, P0.05 ）。 结论： 成功构建了重组腺病毒Ad-mip, 感染Ad-mip 的HEK-293A细胞可表达和分泌目的蛋白 + + + MIP-1α，证明了MIP-1α蛋白能够引起CD3 、CD4 、CD8 淋巴细胞以及单核细胞产生明显 的趋化行为，为进一步研究MIP-1α蛋白在