膝沟藻毒素GTX2,3 idcELISA和纳米金检测方法的研究.pdfVIP

膝沟藻毒素GTX2,3 idcELISA 和纳米金检测方法的研究 摘 要 目的：本研究拟在已初步建立的GTX2,3 间接竞争ELISA 基础上优化反应条 件，提高方法灵敏度；同时以纳米金技术为基础，建立GTX2,3 的免疫层析试纸条 检测方法和新型的免疫吸附生物条码检测方法，从而建立一种更加经济、 用的 麻痹性贝类毒素的检测技术。 方法：制备腹水型 GTX2,3 单克隆抗体，分别利用饱和硫酸铵法、辛酸硫酸 铵法和Protein A 亲和层析法进行纯化。利用所纯化的抗体进行以下研究： 1.对间接竞争ELISA 的包被缓冲液和时间、封闭缓冲液和时间、底物显色时 间及包被抗原、GTX2,3 单抗、酶标亲和素、生物素羊抗鼠 IgG 抗体工作浓度进 行优化； 2.确定单抗与纳米金标记的最佳pH 和最小蛋白浓度，制备二者的偶联物，根 据免疫层析实验原理制备GTX2,3 快速检测免疫层析试纸条； 3.在单抗-纳米金偶联产物的基础上连接硫醇化修饰的DNA ，结合竞争ELISA 原理和PCR 技术将ELISA 中的酶信号转化为可扩增的DNA 信号，建立新型的免 疫吸附生物条码检测方法。 结果：1.使用常规pH9.6 碳酸钠缓冲液37℃ 3h 包被、2%海藻糖37℃ 30min 封闭，15min 底物显色可得到较为满意的阴、阳性值，酶标亲和素和生物素化羊 抗鼠IgG 抗体工作浓度确定为1:8000 和1:3000 ； 2.在pH8.5 条件下使用0.96mg/ml 抗体浓度成功偶联GTX2,3 单抗和纳米金， 组装试纸条，确定质控线工作浓度为2mg/ml ； 3. 成功制备 GTX2,3 单抗- 纳米金- 条码 DNA 复合物，初步建立可检测 0.74 g/ml GTX2,3 的免疫吸附生物条码检测法。 关键词：膝沟藻毒素；ELISA；纳米金；生物条码DNA I Development of the idcELISA, Gold Nanoparticle based methods for determination of the Gonyautoxin2,3 Abstract Objectives: To raise the sensitivity of the indirect-competitive enzyme-linked immunoassay(idc-ELISA) which has been primarily estabilished, many reaction conditions would be optimized; To estabilish Immunochromatography Test Strip and Nanospheres Bio-barcode Technology which can detect Gonyautoxin2,3(GTX2,3), both assays were based on the Nanopaticle technology. So to build a detection system of Paralytical Shellfish Toxins(PSP). Methods: Aaturated ammonium sulphate method (SAS), caprylic-ammonium sulphate method (CAS) and Protein A affinity chromatography were used to purify the mouse ascites. Three assays were investigated using the purified monoclonal antibody (McAb): 1. In Idc-ELISA, the buffer and the time of coating and blocking, the coloration time of substrate, the working concerntration of coating antigen, monoclonal antibody,