绿原酸抑制小胶质细胞活化和防治脂多糖诱导小鼠学习记忆损伤作用的研究.pdfVIP

中文摘要 目的： 本研究采用脂多糖（LPS ）诱导原代小胶质细胞活化的模型，探讨绿原酸抑 制小胶质细胞活化，减轻小胶质细胞活化所致神经元损伤的作用机制；进而采 用 LPS 腹腔注射诱导小鼠学习记忆障碍模型，观察小鼠大脑皮层中炎症介质的 表达，初步探讨绿原酸抑制中枢神经炎症损伤，改善小鼠学习记忆能力的作用 机制，为阿尔茨海默病（AD ）的防治提供实验依据。 方法： 1. 绿原酸对原代小胶质细胞活力的影响 采用胰酶消化法培养原代小鼠小胶质细胞，细胞免疫荧光法鉴定小胶质细 胞纯度，并通过 MTT 和乳酸脱氢酶法，筛选对原代小胶质细胞活力没有损伤的 绿原酸浓度。 2. 绿原酸对 LPS 诱导的原代小胶质细胞 NO 和 TNF-α表达的影响 预处理给予不同浓度绿原酸干预LPS诱导小胶质细胞活化，分别采用Griess reagent 和ELISA方法检测细胞上清中亚硝酸盐（NO2 - ）和TNF-α的含量。进而 用Real-time PCR法观察TNF-α和诱导性一氧化氮合酶（iNOS ）mRNA 的表达； Western blot进一步检测iNOS蛋白的表达。 3. 绿原酸对 LPS 诱导的小胶质细胞中，核因子抑制蛋白（IκBα）磷酸化以及核 因子NF-κB 亚基 P65 核转移的影响。 采用细胞免疫荧光，从形态学上分析绿原酸对 LPS 诱导的 NF-κB 亚基 P65 核分布的改变。Western blot 方法定量检测胞核与胞浆中 NF-κB 亚基 P65 表达， 以及核因子抑制蛋白（IκBα）磷酸化的情况。 4. 绿原酸对小胶质细胞活化介导的神经元损伤的影响 制备绿原酸干预后小胶质细胞条件培养基，通过 MTT 法观察小胶质细胞条 件培养基对神经元活力的影响，进一步通过细胞免疫荧光法，观察绿原酸干预 后的小胶质细胞条件培养基对神经元数目和神经元突起长度的影响。 I 5. 绿原酸对 LPS 导致的小鼠学习记忆障碍的影响 制备 LPS 诱导小鼠学习记忆障碍的动物模型，被动避暗实验和 Morris 水迷 宫实验观察绿原酸对 LPS 诱导的小鼠学习记忆障碍的影响。Real-time PCR 法检 测炎症因子 iNOS 和 TNF-α在小鼠大脑皮层中的表达。 结果： 1. 细胞活力检测结果提示 1-4 mmol/L 的绿原酸作用原代培养的小胶质细胞24 h 后，对其细胞的活力与毒性没有影响，而 8 mmol/L 的绿原酸能对原代小胶质 细胞产生细胞毒性（P0.05 ）。 2. NO 和 iNOS 检测结果表明：绿原酸预处理给药 2 h 能显著抑制 LPS 诱导的 原代小胶质细胞 NO 的释放，并呈现浓度与效应依赖关系（P0.05 ）。4 mmol/L 绿原酸对已诱导生成 iNOS 有直接抑制作用（P0.05 ）。 Western blot 法证实绿原酸可下调 iNOS 蛋白水平的表达，并呈现浓度与效应依 赖关系。TNF-α结果表明：绿原酸预处理给药 2 h 能显著减少 LPS 诱导的原代 小胶质细胞 TNF-α的释放，差异具有统计学意义（P0.05 ）。 3. P65 核分布结果显示：原代小胶质细胞在没有 LPS 刺激的情况下，p65 主要 分布在细胞浆中。而给予 LPS 刺激后，p65 转移进入核内。预处理给予 4 mmol/L 的绿原酸明显阻断了 LPS 诱导的 p65 核转移。同时绿原酸可抑制 IκBα 的磷酸 化，并呈现一定剂量与效应依赖关系（P0.01 ）。 4. 2 mmol/L 绿原酸条件培养基能够抑制 LPS 激活小胶质细胞所致的神经元损 伤，维持神经元的数目和突起的长度。 5. 100 mg/kg 绿原酸腹腔注射 3 周能改善 LPS 所致小鼠学习记忆障碍，抑制 大脑皮层中 LPS 诱导的炎症介质 iNOS 和 TNF-α mRNA 的表达。 II 结论： 1. 体外细胞学实验表明： 1.1 绿原酸通过作用于 IκBα-NF-κB 信号系统，减少 NO 和 TNF-α的表达，抑制 LPS 诱导的原代小胶质细胞活化。 1.2 绿原酸可减轻 LPS 诱导的小胶质细胞活化