夹层胶原“三明治”法短期体外培养肝细胞的实验研究.docVIP

夹层胶原“三明治”法短期体外培养肝细胞的实验研究 殷海涛1滕皋军2刘宝瑞1 南京大学医学院附属南京市鼓楼医院肿瘤科1 南京 210008 东南大学医学院附属中大医院介入放射研究所2 南京 210009 [摘要] 目的：研究胶原、表皮生长因子对新鲜分离Sprague-Dawley(SD)大鼠肝细胞活率、形态和功能的影响，期望建立一种较为完善的肝细胞体外培养体系，为肝细胞移植、生物人工肝及相关肝细胞研究获取充足有效的肝细胞来源提供必须的技术支持和理论依据。方法：采用胶原酶二步原位循环肝脏灌注法分离SD大鼠肝细胞，测定不同条件培养后各组肝细胞的活性及功能。结果：双层胶原及双层胶原＋表皮生长因子组培养后细胞活性、细胞DNA含量及细胞功能均优于普通培养组(P0.05)。结论：双层胶原体外培养体系更接近于肝细胞体内生长环境，能有效的减少各种理化因素对肝细胞的损伤，有利于肝细胞在体外长期保存，是一种较为理想的培养体系。 [关键词] 肝细胞 胶原 表皮生长因子 分离培养 肝细胞移植术始于七十年代，八十年代开始国内外均有临床应用报告，但均未能证实其临床有效性。九十年代以来，随着肝细胞冷藏复苏技术和分子生物学的突破性进展、移植肝细胞标记技术的改进以及介入放射新技术在这一领域的应用，肝细胞移植再次成为新的研究热点[1]。肝细胞移植术具有相对操作简单、对机体影响较小，可重复多次进行，且一个供体可以多个受体使用甚至有望建立肝细胞库等优点。迄今，有大量有关肝细胞移植治疗急性肝功能衰竭的实验及临床应用报告，证实了移植的肝细胞在宿主器官生长繁殖并产生明显的抗肝功能衰竭作用[2-4]。但肝细胞在体外增殖能力差，原代培养难以成功，故在一定程度上限制了肝细胞移植的广泛开展。肝细胞移植不但要求随时可获得充足有效的高质量的肝细胞，而且需要植入体内的肝细胞能保持其形态特征、增殖分化和功能的稳定性。因此，肝细胞移植要想广泛应用于临床并部分替代原位肝移植，必须建立一整套完善的肝细胞分离制备、培养及保存技术。 本实验以SD大鼠肝细胞为研究对象，通过改良Seglen胶原酶原位灌注法分离制备高产量、高活性的肝细胞，从细胞生存的基本条件出发，采用不同的培养体系比较各组肝细胞在相同时间段各项功能的差异，期望探索出一种较为理想的肝细胞培养方法，为肝细胞移植的深入发展提供合理、有效、充足的肝细胞来源。 1材料和方法 1.1实验动物、培养基、试剂和酶 1.1.1东南大学医学院动物实验中心提供的健康SD大鼠，体重180±20克,雌雄随机，普通清洁级。 2培养基：RPMI Medium 1640培养基为GIBCO BRL公司产品。 1.1.3试剂和酶：D-Hank’s 液和Hank’s 液、PBS及胶原均自行制备。Ⅳ型胶原酶购自Worthington biochemical corporation 公司，小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所，DNA酶、Triton-100、表皮生长因子(EGF)、3,5-二氨基苯唑酸、小牛胸腺脱氧核糖核酸多聚体购自Sigma公司，3H-亮氨酸由北京原子能研究所提供。 1.2方法 1.2.1肝细胞的分离 肝细胞的分离采用改良Seglen门静脉-下腔静脉双插管交替循环灌注法，最终经过离心除去杂质即可在较短时间内获得高产量高活力的肝细胞。 1.2.2实验设计 将制成0.5×106/ml的肝细胞悬液，随机分成4组：A组(正常短期原代培养肝细胞组,养液中不含表皮生长因子,此组为对照组)；B组(夹层胶原“三明治”法短期原代培养肝细胞,养液中不含表皮生长因子)；C组(正常短期原代培养肝细胞组,养液中含表皮生长因子)；D组(夹层胶原“三明治”法短期原代培养肝细胞,养液中含表皮生长因子)，分别在37℃、5%CO2条件下培养一周。 1.3观察指标及测定方法 1.3.1形态学观察：OLYMPAS倒置相差生物显微镜及透射电镜观察细胞形态。 1.3.2生化指标：LDH试剂法全自动生化分析仪测定培养上清中LDH含量及肝细胞内ALT含量。 1.4统计学处理：所有数据均以±s表示，采用SPSS统计软件，先进行方差分析，差异显著进行组间两两比较，P0.05时有统计意义。 2结果 2.1肝细胞形态学观察： 2.1.1光镜：在倒置相差显微镜下观察到用交替循环灌注肝脏制备的肝细胞悬液中含有许多单个细胞及少量细胞团，活肝细胞呈透亮、具有立体感的球形、圆形细胞。细胞边界轮廓清晰，细胞核位于细胞正中。各组3小时平均贴壁细胞量分别为：A组37%，B组63%，C组62.8%，D组63.6%。培养24小时后可见各组细胞充分贴附、伸展、呈圆形、椭圆形及多边形。培养36小时后，附壁生长的肝细胞的形态改变更加明显，肝细胞拉平、伸展、呈纺锤形、三角形或不规则多角形等多种形态粘附于培养面上。培养48小时后，整个