大肠杆菌YggG与结合蛋白Era的相互作用研究.pdf

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology，2009，29(11)：36～40 大肠杆菌 YggG与结合蛋 白Era的相互作用研究米 黄 勇 陈苏民 黄庆生 梅其炳 (1西北工业大学生命科学院 西安 710072 2第四军医大学生物化学与分子生物学教研室 西安 710072) 摘要 Era是细菌生长必须的一高度保守的GTPase。yggG是从大肠杆菌全基 因组文库 中钓取并 克隆的Era结合蛋白基因，进一步的研究表明该基因在大肠杆菌中的表达与环境应激相关，提示 yggG基因产物参与细菌的应激调控。为了阐明YggG蛋白与Era蛋白间的相互关系，利用所构建 的双启动子表达载体pDH2一YggG—Ptac—Era在同一细胞中同时表达YggG与Era蛋白，并通过免疫 共沉淀实验检测细菌裂解产物YggG与Era蛋白间的相互作用；在此基础上，构建并表达纯化 了 GST融合的Era蛋 白氨基端截短肽和Era羧基端截短肽 ，通过 GSTPul1．down检测了Era不同功能 区域与YggG蛋白间的相互作用。结果显示，Era／YggG复合物仅存在于同时过表达Era和 YggG 蛋白的细菌细胞 内，不诱导 Era或者不诱导YggG蛋 白过表达 ，均检测不到 Era／YggG复合物存 在 ；纯化的GST不能 Pull-downYggG蛋 白，而纯化 的GST融合的Era蛋 白、Era氨基端截短肽及 Era羧基端截短肽均可以Pull—downYggG蛋白；GST融合Era氨基端截短肽和 GST融合 的Era蛋 白对YggG蛋白结合作用明显高于GST融合 的Era蛋 白羧基端截短肽。上述结果说明，YggG是 一 大肠杆菌 Era结合蛋 白，YggG与 Era的氨基端和羧基端的结合活性存在差异。 关键词 大肠杆菌 Era YggG 中图分类号 Q786 era基因是微生物生长所必需的基因，Era同源分 中，一般认为该结构域与RNA结合有关。与其它RNA 子在生物界分布广泛，从原核生物细菌到真核生物、小 结合基序类似的是，KH基序 以一个或多个拷贝形式存 鼠、人，Era形成一新的G蛋白亚家族，在生物体内发挥 在，KH基序对于体外 RNA结合活性是必需的 。该 着重要的作用 。大肠杆菌的era基因编码的Era蛋 结构域是 RNA结合的特征序列，除了具有VlGxxGxxI 白由301个氨基酸组成，氨基酸序列分析表明：Era蛋 的保守结构外，序列同源性较低，虽然 KH结构域与 白氨基端有4个 GTP结合区(G一1、G一2、G一3、G4)，与 RNA结合的具体位点还不清楚，但这种含 KH结构域 GTP结合蛋白家族的其他家族成员的GTP结合区氨基 的 13c~13折叠是这些RNA结合蛋 白的共性，因此被认 酸序列具有显著的同源性；羧基端端的4个保守区 为是RNA结合的位点。体外突变实验也证明Era蛋白 (Box—A、Box—B、Box—C、Box．D)，与真核 Ras蛋 白及其它 KH结构域的突变明显降低其 RNA结合能力 。这一 G蛋 白均无同源性。因此 Era是一类有别于Ras的新 同时具有G蛋白活性和 RNA结合活性的分子Era，在 的G蛋 白 ]。Era的C端与 KH的 RNA结合结构域 原核生物中参与细胞周期调控和核糖体 rRNA的加工 相似 ]，二者都含有保守的VlGxxGxxIRNA结合基序 与成熟，是细菌生长必需的GTPase分子，era基因突变 (motif)。KH结构域 (hnRNPKHomology)最早发现于 引起的Era分子的GTPase活性缺失或合成减少将导致 人细胞核不均一核蛋白(hnRNP)K中，含70个左右氨 细胞分裂期阻滞和核糖体rRNA成熟障碍 ；在哺乳动 基酸，在进化中相当保守。存在于多种核酸结合蛋 白 物，Era在多种正常组织中表达，Era突变或 Era的表达 减少可引起细胞周期阻滞 。但 目前 Era确切的功能 收稿 日期：2009-02-24 修回Et期：2009-03