大豆胞囊线虫不同虫态DNA提取方法及ITSrRNA扩增.pdf

第36卷 第5期 植 物 保 护 学 报 Vo1．36 No．5 2009年 10 月 ACTA PHYTOPHYLACICA SINICA Oct． 2O09 大豆胞囊线虫不 同虫态 DNA提取方法及 ITSrRNA扩增 DNA extractionmethodsand ITSrRNA analysisfrom different growthstagesofHeteroderaglycine 郑雅楠 段玉玺 孙晶双 陈立杰 (沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110161) ZhengYanan DuanYuxi SunJingshuang ChenLijie (CollegeofPlantProtection，ShenyangAgriculturalUniversity，Shenyang 110161，LiaoningProvince，China) 大豆胞囊线虫病害是大豆胞囊线虫Heterodera DNA2txL。扩增条件为：94cC3min，94℃30S，50℃ glycinesIchinohe(soybeancystnematode，SCN)引起 30S，72℃ 1min，30个循环，72℃ 10min。 的大豆生产中的毁灭性病害。随着研究的深入，分 2 结果与分析 子生物学手段越来越多地应用于 SCN的各项研究 2．1不同方法提取 SCN不同虫态DNA 中，如分类鉴定 、种群遗传规律 及基因功能 ] 用试剂盒提取法和抽提法从J2、白色雌成虫和 等，而高质量的总 DNA及稳定的PCR反应体系是 褐色胞囊中制备的DNA均能够通过电泳检测得到 获取可靠 SCN基因片段的前提。 目前，已有较多关 相应的条带。通过琼脂糖 电泳检测DNA的提取质 于DNA提取技术的研究 J，但对不同方法进行比较 量，以条带整齐单一、清晰明亮为优。采用 WLB法 的报道较少。作者研究了不同方法获得的不同虫态 提取的DNA经电泳检测没有明显条带，抽提法提取 DNA质量和不 同 DNA模板对 PCR扩增产物 的 褐色胞囊 DNA质量优于试剂盒法。在 3种虫态中， 影响。 用雌成虫制备的DNA质量较 J2和褐色胞囊的好 1材料与方法 (图 1)。 1．1DNA提取 2．2 ITSrRNA 段确扩增 抽提法：将 2龄幼虫 (J2)、雌成虫和胞囊分别 采用不同方法从 3种虫态样品中均能制备得到 收集至 1．5mL离心管中，使干物质总体积达到0．1 长度约为 1kb的片段，与预扩增片段大小相 同。且 mL(至离心管0．1mL刻度线处)。用液氮反复冻融 条带均单一清晰。说明采用不同提取方法，从不同 后研磨至匀浆 。DNA提取参照Harmey等 的方法 虫态中提取的基因组 DNA，均能够作为PCR反应的 进行。WLB法：参照Williams等 的方法进行。试 模板进行基因片段扩增 (图2)。 剂盒提取法：使用细菌基因组试剂盒进行提取，方法 3讨论 详见说明书。 本研究结果表明，相 同方法提取 的基 因组 DNA 1．2 ITSrRNA 段 的 璃 中，以白色雌成虫的质量较好，而从褐色胞囊 中提取 通用引物为AB28 (ATATGCTFAAGTrCAGCG— 的DNA样品拖尾现象较严重，可能是由于胞囊皮中 GGT)和 TW81(GTI~CCGTAGGTGAACCTG