固定化细胞酶法拆分N-乙酰-D,L-3-甲氧基丙氨酸.pdfVIP

Vo1．3l 高 等 学 校 化 学 学报 No．8 2010年8月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSInES l560～1563 固定化细胞酶法拆分Ⅳ一乙酰- ，一3-甲氧基丙氨酸 熊吉滨，刘均忠，刘 茜，焦庆才 (南京大学生命科学学院，医药生物技术国家重点实验室，南京210093) 摘要 利用氨基酰化酶固定化细胞酶法拆分了Ⅳ一乙酰一D，，|一3一甲氧基丙氨酸．考察了温度、pH值、底物浓 度 、金属离子和拆分时间对酶促反应的影响．确定了氨基酰化酶固定化细胞手性拆分 Ⅳ一乙酰一D，-3一甲氧基 丙氨酸的最佳工艺条件为pH=7．0、反应温度5O℃及底物浓度500mrnol／L．10 mol／L的co“和Mg“对氨 基酰化酶有显著激活作用，cu 和 zn 对酶促反应有明显抑制作用．在最佳条件下，氨基酰化酶固定化细 胞对 乙酰一一3一甲氧基丙氨酸的摩尔转化率达96％． 关键词 氨基酰化酶；D，L一3．甲氧基丙氨酸；固定化细胞；手性拆分 中图分类号 0629．71 文献标识码 A 文章编号 0251-0790(2010)08—15604)4 丝氨酸是一种重要的非必需氨基酸，在脂肪和脂肪酸新陈代谢及肌肉生长中发挥着重要作用． 具有光学活性的 一丝氨酸不但具有重要的生物及生理学特性 ’2J，而且还是重要的医药中间体 ，在 新药研究、有机合成和多肽合成等领域的应用正引起人们越来越多的关注 J．目前，，J一丝氨酸的制备 方法主要有前体发酵法、生物酶法、蛋白质水解提取法和化学合成法 。。J．近年来，随着酶技术的发 展，利用酶的高度立体选择性进行外消旋体的拆分，已成为制备手性化合物的重要途径．例如，在外 消旋氨基酸等物质的拆分中，通常先将外消旋的氨基酸衍生化，再使用脂肪酶、酯酶、氨基酰化酶或 海因酶等对该衍生物进行选择性水解．氨基酰化酶是一类应用广泛的酰胺键水解酶，在生物体内的氨 基酸代谢过程中起着重要作用 J．由于具有广泛的底物选择性，其很早就被用来分离D，L．氨基酸．钱 绍松等 利用米曲霉产生的氨基酰化酶拆分了D，一茶氨酸，在最适宜条件下，，J一茶氨酸收率达到理论 收率的85％．固定化细胞是用物理或化学的方法使细胞与水不溶性大分子载体结合，或将细胞包埋在 水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的．与游离细胞相比，固定化细胞不仅能保持酶催化的高效 性，还能大大提高酶的热稳定性和化学稳定性 ，有利于酶的循环使用并显著提高酶的使用效率 ¨引． 张飞等 利用氨基酰化酶固定化细胞拆分了Ⅳ一乙酰一D，L一缬氨酸，固定化细胞重复使用 10次，平均转 化率为90．8％．本文利用重组表达的氨基酰化酶固定化细胞拆分了Ⅳ一乙酰一D，一3一甲氧基丙氨酸，考 察了各种反应条件对酶促拆分的影响，为D一或 ，J一丝氨酸的工业化生产提供 了重要依据． 1 实验部分 1．1 仪器与试剂 恒温培养箱(上海跃进医疗器械一厂)；HH4水浴振荡器 (常州 国华 电器有限公司)；P2S电子天 平(上海恒平科学仪器有限公司)；RE2002旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)． 基因工程菌DM202(pET32a—argE／BL21)，本实验室构建；海藻酸钠 ，化学纯，国药集 团化学试剂 有限公司；L一3．甲氧基丙氨酸对照品，本实验室制备 ；乙酸酐，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公 司；茚三酮，分析纯，国药集团化学试剂有限公司． 1．2 D。L-3-甲氧基丙氨酸的乙酰化 称取23．6gD，L一3一甲氧基丙氨酸(0．20oto!)溶于 100mL2mol／LNaOH的水溶液中，在冰水浴条 收稿 日期：2009一l1—19． 皋金项 目：国家技术创新基金 (批准号：02CJ一13-01—16)资助． 联系人简介 ：焦庆才 ，男，博士，教授 ，主要从事氨基酸及手性药物中间体研究．E-mail：jiaoqc@yahoo．com．cn No．8 熊吉滨等：固定化细胞酶法拆分N一乙酰一D，一3一甲氧基丙氨酸 件下缓慢滴加21mL乙酸酐(0．22mo1)，用6mol／LNaOH的水溶液保持pH=9～10，乙酸酐滴完后常