反义bcl-2逆转录病毒表达载体的构建.pdfVIP

第 30卷 第 l2期 湖 北 广 播 电视 大 学 掌 报 Vo1．30，No．12 2010年 12月 JournalofHuBeiTV Unive~ity Decembe~2010．154～ 155 反义bcl一2逆转录病毒表达载体的构建 王 羽 (福州教育学院，福建 福州 350001) [内容提要] 凋亡是一种不同于坏死且受基因控制的主动性细胞 自我消亡过程，亦是许多抗癌药物作用的主 要机理之一。Bcl一2是一种凋亡负控制的重要基因，其蛋白产物能抑制细胞的凋亡或程序性细胞死亡过程。我们 构建了反义bcl-2逆转录病毒表达载体导入多发性骨髓瘤细胞株来调节Bc1．2基因表达，从而诱导细胞凋亡或增加 细胞对凋亡诱导剂的敏感性，来探讨与多发些骨髓瘤的关系。 [关键词] 凋亡；Bc1．2基因；逆转录病毒表达载体 [中图分类号] G71 [文献标识码] A [文章编号] 1008．7427 (2010)12．0154．02 一 、 前言 (1)将 DNA片段用0．1％的TAE琼脂糖凝胶 电泳分离； 凋亡是一种不同于坏死且受基因控制的主动性细胞 自 (2)切下含 1．9kb的目的片段的凝胶，转至一个预先称 我消亡过程，亦是许多抗癌药物作用的主要机理之一。Bc1．2 重 的反应管； 是一种凋亡负控制的重要基因，其蛋白产物能抑制细胞的凋 (3)每 100rag胶加3oo,1胶溶解缓冲液； 亡或程序性细胞死亡过程。Bcl一2基因全长 230kb，由3个 (4)将硅溶液混匀至均一，加 lO山至样本中； 外显子构成，蛋白编码区为外显子 2，3。其编码的蛋白质 (5)56~60~C孵育 10分钟，然后涡状混匀2～3分钟； 分子量为 26kD，常定位于胞膜和胞浆中的线粒体膜、核膜 (6)12000g，离心 30s，弃上清； 及光面内质网上。Bcl一2基因的功能在于防止细胞衰老，Bcl一2 (7)用 5oo0a核酸结合缓冲液重悬基质，如上步骤离心， 过度表达时，细胞凋亡减少、促进细胞生长，寿命延长，故 弃上清； Bc1．2基因又成为长寿基因。由于Bcl一2是一种抗凋亡基因， (8)用5oo0a洗脱缓冲液洗脱，如前述离心，弃上清液； 因此，我们构建了反义bcl一2逆转录病毒表达载体导入多发 (9)重复上步骤 1次； 性骨髓瘤细胞株来调节Bcl一2基因表达，从而诱导细胞凋亡 (10)弃上清 ，室温下干燥 ； 或增加细胞对凋亡诱导剂的敏感性，来探讨与多发些骨髓瘤 (11)加入2O～50ul水溶解DNA，12000g离心 30s，将 的关系，以及与c．myc、P53等基因的关系。 上清 (含DNA)转至一个新的EP管中，．20~C保存备用。 二、材料与方法 2．2逆转录病毒载体 pLXSN的线性化及回收：EcoRI 1．质粒与载体 酶切pLXSN，回收质粒大片段。 含人 bcl一2eDNA 的质粒 paluescfip—ks．bc1．2 由美 国 酶切体系为： Ko~meyer教授惠赠 ，山 1|9kb 的人 bcl一2cDNA 克隆至 pLXSN 1 pBluescfiptKs的E