小鼠分泌型IL-1β真核表达载体的构建及其表达.pdfVIP

744 ISSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志 (ChinJCellM0Jlmmun01)2011．27(7 · 论著 · 文章编号：1007—8738(2011)07—0744～03 小鼠分泌型 IL-1I3}真核表达载体的构建及其表达 肖伟玲，王雪净，牟东珍，林志娟，王焕芹，梁淑娟 (潍坊医学院免疫学教研室 山东省高校免疫学重点实验室 ，山东 潍坊 261053) [摘 要] 目的：构建小鼠经典分泌途径 IL一1B真核表达载 1 材料和方法 体 ，转染至Hepal一6细胞 ，并测定其分泌表达水平。方法 ：引 1．1 材料 工程菌 E．coliDH5ct、质粒 pIRES2一EGFP，本室 物延伸获得小鼠AFP信号肽序列(sAFP)，RT—PCR扩增获得 保存。引物由上海生工生物技术公司合成，测序分析由大连 小鼠IL一1B成熟蛋白基因序列(mIL一1p)，SOE方法将两段序 宝生物公司完成。 DNA聚合酶、T4连接酶、XhoI、EcoR 列拼接形成融合基因，与pIRES2一EGFP质粒重组构建分泌型 I等工具酶均购 自大连宝生物公司，DNAMarker购 自美 国 真核表达载体pIRES2一EGFP．smIL．1B，并将其转染至 Hepal一6 Promega公司。DMEM培养基购 自美国Gibco公司；兔抗 鼠 细胞，RT-PCR检测融合基因的表达水平，Westernblot检测 IL一1B抗体和HRP标记山羊抗兔多克隆抗体均为NEB公司， 细胞内mIL一1B蛋白的表达，ELISA法测定培养上清及细胞裂 鼠抗GFP抗体为Abcam公司；ECL发光试剂盒为PierceBio— 解液中mIL一1B水平。结果：经 SOE法拼接获得的融合基因 technology公司；小 鼠IL一131betaELISAReady—SET—Go检测试 与 GenBank中登录的序列一致，RT—PCR检测显示该载体能 剂盒为 eBoscience公司；Hepal-6细胞购 自中国科学 院细 够在Hepal一6细胞中表达融合基因mRNA，细胞培养上清中 胞库。 raiL一1p的分泌水平明显上升，而胞质 中的mIL一1B无明显变 1．2 方法 化。结论：成功地构建了经典途径分泌的naiL一1B重组表达载 1．2．1 小鼠腹腔 巨噬细胞 的分离及细胞总RNA的提取 小 体，该载体可以在 Hepal一6细胞培养上清中有效分泌具有生 鼠腹腔内注射60 L无菌淀粉肉汤0．5mL，48～72h后收集 物活性的naiL一1B。 腹腔冲洗液，LPS(5mg／L)刺激 4h，TRIzol法提取细胞总 [关键词] 鼠白细胞介素 1B；信号肽；分泌表达；肝癌细胞 RNA，用于扩增小鼠mlL—lB基因序列。 [中图分类号]R392．12 [文献标识码]A 1．2．2 引物重叠延伸合成小鼠AFP信号肽序列 延伸扩增 小鼠AFP信号肽 的引物为：P1：5，_CCGCTCGAGATGAAG— 白细胞介素 1(IL．1B)是促炎性细胞因子中的重 TGGATCACACCCGCT-3-，(引入XhoI酶切位点)；P2：5一T— 要成员，主要参与各种急慢性炎症反应 ¨J，然而近 GCr丌vIGGACGCAGCGAAATGTAGCAGGAGGATGAGGGAAGC— G【 一3(下划线部分为引物问的互补序列 ，通过引物重叠 年来又有研究显示，该因子介导的慢性炎症在肿瘤 延伸得到小鼠AFP信号肽序列。P2引物5端有与小鼠IL一1t3 的形成和转移过程中也发挥着重要作用 。我们 成熟蛋白编码基因的前 12个碱基即 P3引物互补的序列)。 前期的体内实验表明，IL-1B升高可以明显下调 N