多黏芽孢杆菌Dw-6抗革兰氏阳性菌多肽的分离纯化及抑菌活性机理.pdfVIP

江苏农业科学 2011年第39卷第3期 文风云，董淑丽，李晓丽，等．多黏芽孢杆菌Dw一6抗革兰氏阳性菌多肽的分离纯化及抑菌活性机理_jj．江苏农业科学，2011，39(3)：408—41 多黏芽孢杆菌Dw一6抗革兰氏阳性菌多肽的 分离纯化及抑菌活性机理 文凤云，董淑丽，李晓丽，李文巧，谢三磊，李俊强 (河南科技大学动物科技学院，河南洛阳471003) 摘要 ：多黏芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)Dw一6是 1株具广谱抗菌活性的拮抗菌株。该菌株发酵液经热处 理、固相萃取及柱层析得到了1个单峰化合物DwGPB。该化合物对蛋白酶 K较为敏感 ，但对胰蛋白酶不敏感。对供 试革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和苏云金杆菌均具有强烈的抑制活性。苏云金杆菌经 DwGPB处理 后 ，细胞膜局部破损，内含物泄露，推测是在细胞膜上形成孔洞而导致细胞裂解。 关键词：多黏芽孢杆菌 ；抗菌肽；分离纯化；抑菌活性 中图分类号：R284．2 文献标志码 ：A 文章编号：1002—1302(2011)O3—0408—03 芽孢杆菌(Bacillusspp，)是一类重要的生防细菌 ，由芽孢 (TFA)、乙腈 (ACN)为色谱纯，其余均为国产分析纯。 杆菌产生的多肽类物质对多种植物真菌和细菌病害在活体和 1．2 发酵液的制备及抑菌活性检测 离体条件下都表现出很强的拮抗活性 。多黏芽孢杆菌 活化的Dw一6菌株接种于 5mL发酵液体培养基中， (Paenibacilluspolymyxa)能够产生抗菌素和抗菌蛋 白等多种 30℃、150r／min培养 20h，l％接种量转接到 50mL发酵培 生物活性物质，在植物病害防治方面具有诱人的前景 。越 养基中，30℃、150r／rain培养48h。4℃、10000r／min离心 来越多的拮抗性多黏芽孢杆菌被分离筛选出来 ，并表现出较 30min，收集上清液。抑菌活性检测采用琼脂糖平板孔穴扩 好的抑菌活性 。笔者所在实验室前期工作中筛选获得 1 散法 ：取 20tzL培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌菌 株具广谱抗菌活性的拮抗多黏芽孢杆菌菌株Dw一6，并发现 液，加入到 10mILB固体培养基中，混匀，倒入培养皿 ，待凝 该菌株发酵上清液中抗菌活性组分具有专一拮抗性。Dw一6 固后在平板上打孔，取 6IxL待测样品加入小孑L中，37℃培养 菌株所产拮抗物质抗菌谱广，其中包括能很好地抑杀供测试 过夜后测量抑菌囤直径。 的革兰氏阳性菌 、革兰氏阴性菌和真菌的多种活性组分。本 1．3 抗 G 菌蛋 白热稳定性试验 研究重点探讨 Dw一6菌株所产生的抗革兰氏阳性菌抗菌肽 Dw一6菌发酵液上清 ，分别于40、50、60、70、80、9O、 DwGPB的分离纯化及抑菌活性机理。 100℃处理 l0、20min后进行抑菌活性检删；未经』儿J热处理的 发酵液作为对照。 1 材料与方法 I．4 抗 G 菌多肽的分离纯化 1．1 材料 经 100oC、20mill处理后 的Dw一6茁发酹液 ，于 4℃、 1．1．1 供试菌种 多黏芽孢杆菌菌株Dw一6由笔者所在实 10000r／min离心30rain，上清液用0．45 m微孑L滤膜过滤备 验室分离获得；G 指示菌 ：金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus 。 固相萃取：用0～100％甲醇 (V／)30mL做分步梯度洗 aureus)、枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)、苏云金杆菌 (B． 脱，流速2m|Jmin，各组分分别用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 thuringensis)，G一指示菌：大肠杆菌 (EscherichiacoliKl2D31)， 及出芽短梗霉为指示菌做活性检测 ，以