淡色库蚊抗溴氰菊酯品系CYP4家族新成员基因克隆及序列分析.pdfVIP

维普资讯 中国寄生虫病防治杂志 2004年4月 第17卷第2期 ChinJ ParasitDisCon April2004． Vo1．17，No．2 ·65 · 淡色库蚊抗溴氰菊酯品系CYP4家族 新成员基因克隆及序列分析* 滕达，李秀兰，公茂庆 ，马磊 ，陆洵蔚 ，孙艳 ，朱昌亮一 (南京医科大学病原生物学系，江苏南京 210029) 【摘要】 目的 获取淡色库蚊 CYP4家族新基因。 方法 根据 CYP4氨基酸保守序列设计一对简并引物，采用 RT— PCR的方法，从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系四龄幼虫总 RNA 中扩增 出与设计相符的基因片段。利用 T／A克隆方法，将 获得的基因片段克隆入 pGEM—Teasy载体，经 PCR鉴定重组成功，测序并进行比对 。 结果 共克隆出36个阳性克 隆，将其中9个随机挑取的阳性克隆测序及 同源性分析，表 明为 CYP4家族 中9个新的cDNA序列，由GeneBank登录 上网；经国际细胞色素 P450命名委员会鉴定，属 CYP4家族 CYP4H、CYP4J亚家族 。为进一步研究细胞色素P450的 多样性及其与抗药性的关系打下基础 。 结论 克隆9个淡色库蚊基 因部分序列 ，被鉴定属于 CYP4家族 CYP4H、 CYP4J亚家族。 【关键词】 淡色库蚊 ；细胞色素 P450；基 因克隆 ；CYP4 【中图分类号1 R384．1 【文献标识码】 A 【文章编号1 1001—6627(2004)02—0065—03 目前已知，细胞色素 P450介导的解毒代谢增强 3 RNA提取、纯化与 cDNA合成 是昆虫对拟除虫菊酯杀虫剂产生抗性 的重要机制之 取约 1g(约 1000只)淡色库蚊抗溴氰菊酯品系4 r】 ] 一 。 在 昆虫 P450基 因超家族 (superfamily)中， 龄幼虫，加入液氮在研钵 内研成粉末 ，移至匀浆器 内， CYP4作为一个成员众多的家族已越来越引起人们的 采用 TRholReagentKit提取总 RNA，196／琼脂糖凝 重视。目前 ，昆虫 P450基 因CYP4家族 已从 23种 昆 胶 电泳观察结果 ，分光光度计 比色测定总 RNA纯度。 虫 (GeneBank，2003)克隆了 216个基 因或变异体 。 用 PolyA TtractmRNA IsolationSystem Kit从 0．5 Scott等[2 曾对 CYP4基 因结构特征及其与系统进 mg总 RNA 中进行纯化 。取抗性品系mRNA2 g以 化的关 系进 行 了较为深 入 的研 究。然 而，对 昆虫 SMART cDNA LibraryConstructionKit合成 cD— CYP4家族 的功能至今知之甚少 。本实验根据 CYP4 NA。操作均按产品说 明书进行。 家族的P450蛋 白的保守区段设计简并引物，以抽提 4 引物合成 的RNA为模板 ，采用 反转 录聚合酶链 反应 (RT- 根据 GenBank中的昆虫 P450氨基酸保守序列和 PCR)，从淡色库蚊 (Culexpipienspallens)抗溴氰菊 Scott等r3]报告的P450引物设计 1对简并引物。上游 酯品系中克隆获得 CYP4家族成员的基因片段 ，以期 引物 P1编码 P450蛋白疏水螺旋 工区的一部分 ，被认 寻找到与抗性有关的成员，为进一步从分子水平 阐明 为是 CYP4家族 的特异序列 ；下游引物 P2位于与血 蚊虫 CYP4家族参与杀虫剂抗性 的机理奠定基础。 红素结合的半胱氨酸残基周 围部位 ，其 F—G—C—G 结构是 P450超家族的共