高密度发酵P.pastoris组成型表达纤维素二糖水解酶.pdfVIP

第 3l卷 第 8期 热 带 作 物 学 报 Vo1．31 No．8 2010年 8月 CHINESE JOURNAL OFTROPICAL CROPS Aug．2010 高密度发酵 pastoris组成型 表达纤维素二糖水解酶 崔艳艳 一，易国辉 ，屠发志 ，张添元3，罗进贤 。，张爱联 ” 农裹业翌部冀热雾带作荔物茎生物蓑技术秉重圭点葬开放篓实验蠢室霎海碍南海口571101 2海南大学农学院．海南儋州 571737 3中山大学基 因工程教育部重点实验室 ／生物化学系，广东广州 510275 摘要 用 PCR法扩增里 氏木霉 c6^Ⅱ基 因，并将其克隆到 past0r／s表达载体 pGAP9K，获得重组表达质粒 pGAP9K—cbh1I。通过电转法将 c6 Ⅱ基 因整合到P paztoris的基 因组中，然后筛选高 G418抗性 的克隆作为工程菌 菌种 在生物反应器中生产 CBHⅡ．将 20L发酵液装人50L的发酵罐中，在发酵过程中连续64h补加甘油一PTM4， 放罐时生物量为Aa~o=170．CBHlI的表达量为 75mg／L。其表达产物具有酶解羧甲基纤维素的活性 。 关键词 纤维素二糖水解酶 ：毕赤酵母 ：基因表达 ；纤维素酶活力 doi 10．39696．issn．1000—2561．2010．08．010 中图分类号 Q556 葡聚糖外切酶 (Exo-1。4一B—D-glucanase，EC3．2．1．91)作用于纤维素线状分子末端 ，水解 p一1，4一D一14 糖苷键 ．依次切下一个纤维二糖分子 ，故又称为纤维二糖水解酶 (Cellobiohydrolase)(简称 CBH)I”。葡聚糖 外切酶与内切葡聚糖酶和 B一葡萄糖苷酶 的协同作用下能将植物纤维素分解为葡萄糖 ，葡萄糖可作为食 品 也可作为生产生物能源乙醇的原料2[1。 在 自然界 中．存在多种产纤维素酶能力的微生物 ，包括真菌、细菌和放线菌等 ，并且来源不同的微 生物所产纤维素酶的活力不 同．里 氏木霉所分泌的纤维素酶是 目前普遍认为酶活力较强 的纤维素酶3『l。由 于天然酶的产量普遍都很低 ，所以这些微生物 目前还不能广泛 的用于工业生产中 。异源表达纤维素酶是 一 种较为理想的策略。Pichiapastoris( pastoris)是近些年来迅速发展 的一种表达宿主 ，具有安全 、高效 和适于进行高密度发酵的优点5_【。 pastoris能生长至很高的细胞密度 (40％～50％ v／v)并分泌产物于发酵 液中。还具有真核生物的转录后加1二的能力嘲。近20年来 ，pAOX1是普遍应用的P pastoris的表达系统。 其主要不足之处是需要 甲醇作为唯一碳源来诱导它所调控的基因表达 ，而甲醇是毒性易挥发物质 ，在生 产中使用 ，容易造成环境污染[71。pGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是近些年来新发展 的 pastoris的组 成型表达系统 ．可以应用无毒性的甘油或葡萄糖等作为唯一碳源进行调控基 因的表达 ，并且产物量较高 ， 操作方便[8-9]。 高密度发酵是通过补料 的策略．使细胞长至较高的密度仍然维持 良好 的生长状态 ，以较多的生物 量表达较多的产物 ．是大规模生产重组蛋 白的一种主要措施 l0『】。基于此 ，笔者研究了以高密度发酵使 尸．Dastori5组成型表达 c6 Ⅱ基 因，旨在为今后大规模生产重组 CBHI1酶奠定基础 。 基金项 目：国家 8“63”项 目(No．2007AA021307)，中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项 目(No．ITBBZX2008—4—2)资助。 第一作者简介 ：崔艳艳 ，女，1980年生，硕士研究生 。研究方 向：微生物基 因工程 。E-mail：ya“yancui2O00@yah)【l【_ell。 通讯作者 ．张爱联 ．E—mail：zhangailian6@yahoo．con．an。 收稿 日期 ：2010—03—22 2010—07—16 热 带 作 物 学 报 31卷