骨髓基质干细胞向神经细胞诱导分化的形态学研究.pdfVIP

维普资讯 2005年第 45卷第 11期山东医药 骨髓基质干细胞向神经细胞诱导分化的 形态学研究 张 宏 刘兆华 范书静。 【关键词】 骨髓基质干细胞 神经细胞 分化 形态学 【中图分类号】 Q254 【文献标识码】 A 骨髓基质干细胞 (BMSCs)是骨髓内的一种多潜 态学变化，诱导完毕后应用 1 甲苯胺蓝溶液进行细 能的干细胞，具有多向分化及 自我更新的能力，参与 胞染色 。 组织细胞的替代及修复。在一定条件下，BMSCs可 1．4 免疫细胞化学鉴定 应用抗人Nestin单抗及 分化为中胚层 以外的组织。2004年 5月～8月，我们 小鼠抗 MAP单抗分别于诱导后 5小时、24小时及 通过研究体外人胚向神经细胞诱导分化过程的形态 第 5天进行免疫细胞化学鉴定(SP法)。 学变化规律，旨在为BMSCs的开发应用提供实验依 2 结果 据。 2．1 人胚BMSCs生长状况 初接种时镜检见多数 1 材料与方法 为红细胞，随着换液次数增多，红细胞逐渐消失．仅 1．1 主要材料 a—MEM 培养基 (GIBCO公司)、人 剩下BMSCs。该细胞贴壁生长，为扁平的多角形。第 碱性成纤维细胞生长因子 (hFGF—b，Chemicon公 5天可见细胞克隆呈菊花状或簇状，散在分布，克隆 司)、抗人巢蛋 白(nestin)单抗 (Chemicon公司)，小 中的细胞形态大多呈梭形，也有少量大的扁平状细 鼠抗胶质纤维酸蛋白(GFAP)单抗 (SantaCruz公 胞和小的圆形细胞；至7～14天贴壁细胞融合成单 司)，小鼠抗微管相关蛋白一2(MAP)单抗、大鼠抗磷 层，贴壁生长，呈旋涡状、栅栏状排列。 脂碱性蛋白(MBP)单抗、B一巯基乙醇(BME)、明胶均 2．2 BME诱导过程的形态学变化 经BME诱导 由Sigma公司提供，胎牛血清，1 甲苯胺蓝溶液，SP 15分钟后，一些BMSCs即出现肉眼可见的形态学变 免疫组化试剂盒 (福州迈新生物技术开发公司)。 化，随时间的延长，逐渐表现为典型的神经元细胞的 1．2 人胚BMSCs培养 取 自然流产的孕 3个月的 形态特征。诱导后 1小时，BMSCs的细胞质向细胞核 胚胎 (经医院伦理委员会批准及产妇家属同意)，无 回缩，细胞体逐渐呈多极形态，可表现为圆形、锥形 菌条件下取出股骨，剪开骨髓腔，用D—Hank’S液冲 或不规则形，并逐渐向外延伸，折光性增强。诱导时 洗，细胞悬液移入离心管。以1200r／min离心5分钟， 间越长，表现为神经样细胞形态的数量越多。观察发 弃上清，再重复离心1次。将细胞转移入4孑L板中，培 现，细胞出现形态变化的时间并不一致 。细胞失去 养体系中含 a—MEM、10 胎牛血清及终浓度为 BMSCs形态，表现为典型的神经元样，逐渐伸出树 lOOU／ml青霉素和 100gg／ml链霉素，在 5％CO：、饱 突和轴突，形成单极、双极和多极神经细胞形态。于 和湿度、37C条件下培养。3天后常规换液，待原代培 诱导后 6小时 11．7295／±3．O496／的细胞内出现颗粒 养的细胞生长至接近融合状态时，按 1：2进行传代 状物质并逐渐发生凋亡。甲苯胺蓝染色可见细胞突 培养，以后隔 日换液。 触着色，多个神经样细胞的突起可相互连接成网状。 1．3 人胚BMSCs诱导分化 选取生长 良好的第 5、 诱 导 5天后，发 生凋亡的细胞 数量 为 79．44 ± 7、9代的人胚BMSCs，0．2595／胰酶消化后，将细胞转 3．67％。 移至包被好的培养皿中，细胞数为8000个 ／cm 。培 2．3 免疫细胞化学鉴定结果 诱导后5小时、24小 养体系含有 1O％胎牛血清、10ng／ml的bFGF。经 时及第 5天，免疫细胞化学显示 Nestin表达随诱导 lmmol／I的BME预诱导24小时后，加入 5mmol／I 时间的延长逐渐降低，而MAP表达逐渐升高。 的BME诱导6小时，于诱导过程中实时监测细胞形 3 讨论