出口食品中阪崎肠杆菌快速检测方法 胶体金法 编制说明.docVIP

《出口食品中阪崎肠杆菌快速检测方法 胶体金法》（2011B302k）编制说明 任务来源 本标准是按照国家认证认可监督管理委员会2011年下达的行业标准制定计划，计划编号2011B302k，标准名称《出口食品中阪崎肠杆菌快速检测方法 胶体金法》，专业类别：食品。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口，由承担研究和起草工作。检验检疫局接到标准制定任务后，由起草标准的负责人成立了标准起草小组。标准起草小组通过查阅大量资料SN/T1632.1-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法 第1部分：分离与计数方法GB 4789.40-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验GB/T1.1-2009 标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写本标准的征求意见单抗标记量的确定 溶液中阪崎肠杆菌单克隆抗体的最适蛋白量为10 μg。根据能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量原则，阪崎肠杆菌单克隆抗体的最佳标记蛋白量为11μg（表1）。 表1阪崎肠杆菌单克隆抗体的最佳标记蛋白量 蛋白浓度（μg/mL） 1 2.5 5 10 15 20 25 30 胶体金溶液是否聚沉 + + + - - - - - 包被浓度的确定 将抗体稀释为一系列的浓度，从表2可以看出最适包被浓度在1～4 mg/mL。 表2阪崎肠杆菌单抗包被浓度的选择 抗体浓度（mg/mL） 阴性样本检测结果 阳性样本检测结果 0.25 T线不显色，没有浅影 T线显色很浅 0.5 T线不显色，没有浅影 T线显色为淡红色 1 T线不显色，没有浅影 T线显色为红色，符合标准 2 T线不显色，没有浅影 T线显色为红色，符合标准 4 T线不显色，没有浅影 T线显色为红色，略显深 8 T线不显色，没有浅影 T线显色为深红，下深上浅 12 T线不显色，没有浅影 T线显色为深红，下深上浅 金标抗体喷量的确定 从表3可见，阪崎肠杆菌单抗-胶体金结合物的喷量为3.0 μL/cm 时，T/C线显色深浅适中，阳性样本梯度明显。 表3阪崎肠杆菌单抗-胶体金结合物喷量的选择 金标抗体喷量（μL/cm） 1.0 2.0 3.0 5.0 8.0 显色深浅 显色太浅 显色适中 显色适中 显色稍深 显色过深 梯度大小 梯度不明显 梯度较明显 梯度明显 梯度明显 梯度较小 样品缓冲液的选择 从表4可见，pH7.4 0.05 M PBST缓冲液（含1.5%S17）和pH7.4 0.1 M PBST缓冲液（含3%S17）均能达到较好的显色效果，但是从原料方面考虑pH7.4 0.1 M PBST缓冲液（含3%S17）用料较多，故采用pH7.4 0.05 M PBST（含1.5%S17）缓冲液为佳。 表4 样品缓冲液的选择 样品垫种类 pH7.4 0.01 M PBST缓冲液 pH7.4 0.01 M PBST缓冲液（含1%S17） pH7.4 0.01 M PBST缓冲液（含4.5%S17） pH7.4 0.01 M PBST缓冲液（含8%S17） 显色情况 跑板速度符合，但跑完后膜面红 T线有浅影 T线有浅影 显色浅 样品垫种类 pH7.4 0.02 M PBST缓冲液 pH7.4 0.05 M PBST缓冲液 pH7.4 0.05 M PBST缓冲液（含1.5%S17） pH7.4 0.1 M PBST缓冲液（含3%S17） 显色情况 跑板速度符合但跑完后膜面红 跑板速度较慢，且但跑完后膜面红 跑板速度符合，膜面干净，满足要求 跑板速度符合，膜面干净，满足要求 注：S17为表面活性剂非离子型聚氧乙烯（20）油醇。 样品垫pH值的确定 从表5可见，采用H3-4的样品垫较为合适。 表5 不同pH值的样品垫的显色结果 样品垫pH值 1-2 3-4 5-6 11-12 阴性显色情况 显色正常 显色正常 显色正常 不显色 阳性显色情况 梯度小 梯度明显 几乎没梯度 不显色 试纸条各指标描述 抗阪崎肠杆菌抗体原浓度12.08mg/mL用普通稀释液稀释到2mg/mL作为T线，点到硝酸纤维素膜上，二抗 090916 原浓度26.56mg/mL稀释到1.0mg/mL作为C线点到硝酸纤维素膜上。点好的卡放在25℃的干燥室干燥一夜。将单抗标记为标记量10，OD值25的金标溶液，选择喷量为3.0点到聚酯膜上干燥的金标条，组合上pH3-4样品垫制成试剂条。采用pH7.4 0.05 M PBST（含1.5%S17）缓冲液作为研磨液研磨样本，能得到良好的产品。 试纸条应用 取阪崎肠杆菌标准菌株ATCC 244，培养，10倍梯度稀释，平板计数，无菌操作加入购买的牛奶，细菌终浓度101~108CFU/mL，取检样100mL加入已预热至44℃装有900mL 缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，用手缓缓