化学品 蛙类非洲爪蟾生殖内分泌干扰毒性试验.docVIP

目 次 前言 3 1 范围 4 2 术语和定义 4 3 方法原理 4 4 受试物信息及储备液配制 4 4.1受试物信息 4 4.2 储备液配制 5 5 仪器设备与试剂 5 5.1 仪器设备 5 5.2 试剂 5 6 受试生物非洲爪蟾 5 6.1饲养条件 5 6.2 种蛙饲养 5 6.3 诱导繁殖 6 6.4 受精卵孵化 6 6.5 蝌蚪饲养 6 7 试验程序 6 8 数据处理 7 9 试验结果和分析 7 10 试验可接受性标准 8 11 试验报告 8 参考文献 9 图1 非洲爪蟾卵巢（a）和精巢(b)形态 7 图2 非洲爪蟾性腺组织学结构 7 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准技术内容根据2004年美国环境保护局发表的《两栖动物生长和生殖试验》[1]，建议将其作为鉴别化学物质内分泌干扰作用的第二级方法使用。近年来，有大量相关内分泌干扰物对两栖动物生殖发育影响的报道[1]-[5]。在参考相关资料的基础上，我们提出了《化学品 测试生殖内分泌干扰作用的非洲爪蟾性腺分化试验》方法，以用于测试化学品及相关的药品、食物添加剂和污染物的生殖内分泌干扰作用。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国科学研究院生态环境研究中心。 本标准主要起草人：陈会明、程艳、秦占芬、崔媛、楼钦钦、赵亚娴、李晞。 化学品 蛙类非洲爪蟾生殖内分泌干扰毒性试验 1 范围 本标准规定了《化学品 蛙类非洲爪蟾生殖内分泌干扰毒性试验》方法。 本标准适用于化学品对非洲爪蟾的生殖内分泌干扰毒性作用测试。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准. 2.1 半静态法（semi-static test） 试验期间每隔24小时更换一次药液，要求化学测试物的性质在这一时间内相对稳定（即浓度波动在初始浓度的20%之内）。 2.2 流水系统（flow-through test） 通过一套连续配制与稀释化学品贮备液的系统，使试验药液稳定连续地输送到试验缸中。调节水流，确保缸内的药液浓度变化小于20%。 2.3 MTC 化学物引起小于10%急性死亡率的最高试验浓度。 3 方法原理 非洲爪蟾雌雄性腺分化完全，卵巢与精巢结构差别明显，分化过程中对生殖内分泌干扰物敏感，可出现性腺结构异常、性别比异常等现象。因此，可以根据非洲爪蟾性腺分化的特征，测试化学品的生殖内分泌干扰作用。 4 受试物信息及储备液配制 4.1受试物信息 受试物需包含以下信息： a) 名称和结构式 b) 水中溶解度； c) 来源和纯度； d) 在水中和光照下的稳定性。 4.2 储备液配制 根据受试物的最终试验浓度确定储备液的浓度，用去离子水或其它合适的溶剂配制受试物储备液；根据储备液在溶剂中的稳定性决定储备液的有效时间；如果受试物易光解，需要对其避光保存。 5 仪器设备与试剂 5.1 仪器设备 仪器设备应包括: 溶氧仪 pH计 光强计 可调式移液器 (10μL ~ 5000 μL)或大小相当的吸量管石蜡切片机 玻璃饲养缸 电子分析天平 解剖显微镜 孵化筛 温度计 切片机 包埋机 生物显微镜 5.2 试剂 人绒毛膜促性腺激素(HCG) 乙醇 冰醋酸 苦味酸 石蜡 二甲苯 石蜡切片脱蜡染色试剂盒 6 受试生物非洲爪蟾 6.1饲养条件 6.1.1 经过除氯的自来水用来饲养黑斑蛙，除氯的方法可选择亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或活性炭几种方式，以水中不能检出余氯为准。水质要求溶解氧（DO）浓度 3.5 mg/L（空气饱和的40%），pH保持在6.5 ~ 8.5，电导率500μS ~ 3000μS，水质硬度在175 mg/L ~ 300 mg/L之间（以CaCO3计），总碱度在 50 mg/L ~ 200 mg/L（以CaCO3计）, 碘化物（I-）浓度在0.5 μg/L ~ 10 μg/L，总氨氮0.5 mg/L，非离子氨0.02 mg/L,亚硝酸盐0.5 mg/L,硝酸盐50 mg/L, 总余氯为0。 6.1.2 温度维持在25°C ± 1 °C。 6.1.3 全波长荧光灯营造自然光照条件，明暗光周期12 h / 12 h，蝌蚪缸水面光强约600 Lux ~ 1000 Lux，蛙缸水面光强约200 Lux。 6.1.4 使用玻璃缸为养殖蝌蚪和蛙的容器。 6.2 种蛙饲养 种蛙在大型缸中静水饲养，雌雄分开，饲养密度不高于1只/5 L水。每周喂食2次，饲料按猪肝：合成饲料为1:1的比例调配，喂食2 h后换水。 6.3 诱导繁殖 6.3.1 孵化缸中注入清水，放置孵化筛，准备诱导繁殖条件。 6.3.2 选取前一天没有喂食的一对非洲爪蟾种蛙，雌雄分别注射