抗冻蛋白AFPⅢ的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备.pdfVIP

第28卷第 11期 水 产 科 学 Vol_28No．11 2009年 11月 FISHERIES SCIENCE NOV．2009 抗冻蛋 白AFPⅢ的原核表达、纯化及 多克隆抗体的制备 郝凤霞 ，胡文革 ，付伟超 ，康庄丽 ，张桂玲 (1．新疆石河子大学 生命科学学院，新疆 石河子 832002；2．新疆石河子大学 食品 科学学院，新疆 石河子 832000) 摘 要 ：采用基 因重组技术将 AFPⅢ基 因与原核表达载体 pET32a(+)连接 ．转化大肠杆菌 BL2l (DE3)，通过 PCR、单双酶切及测序鉴定构建结果 。用 IPTG诱导蛋白表达 ，将融合蛋 白纯化后 ，免疫 6 — 7周龄的小 白鼠，制备 AFPⅢ多克隆抗体 ．采用 Western印迹法检验抗体特异性 通过酶联免疫吸 附试验(ELISA)测定多克隆抗体滴度。成功地构建了AFPⅢ的原核表达载体，经在大肠杆菌中诱导表 达 、镍柱亲和层析纯化 ，得到较纯的相对分子质量约 26000Da的融合蛋白，免疫小 白鼠后得到多抗血 清 ．Western印迹结果显示此多克隆抗体与 AFPm 蛋 白特异性结合 。该试验为进一步研究 AFPm在 转基 因鱼 中的定点表达 以及作用机制奠定了基础 。 关键词 ：抗冻蛋 白；原核表达；重组融合蛋白；纯化 ；抗体 中图分类号 ：Q51 文献标识码 ：A 文章编号 ：1003-1111(2009)11-0671-04 抗冻蛋白是一类抑制冰晶生长的蛋 白质 ，能 以 使 目的蛋白的高效表达后得到纯化的融合蛋 白，构 非依数性 (Noncolligative)形式 降低水溶液 的冰 建了能利用组氨酸标签的原核表达载体，应用 了亲 点，但对熔点影响甚微 ，从而导致水溶液的熔点和 和层析技术对融合组氨酸标签的表达产物进一步 冰点之间出现差值，这种差值称为热滞活性或抗冻 纯化 ，获得有活性的重组蛋 白，直接用于蛋 白功能 活性 ，差值越大 ，抗冻活性越大，因此抗冻蛋 白亦称 的研究 ]。 为热滞蛋 白(ThermalHysteresisProteins，THPs) 1 材料与方法 或温度迟滞蛋 白。其抗冻活性的大小用 THA来 表示 [1]。AFPUI是抗冻蛋白的一种 ，为球状结构 的 1．1 材料及仪器 蛋 白分子 ，分子组成和顺序与其他的抗冻蛋白完全 质粒 PEGFP—N1一AFPⅢ由中国科学院遗传与 不同，没有 占优势的非极性氨基酸。其二级结构主 发育研究所陈 良标教授 惠赠 。本 实验室将该质粒 要是 由9个 p一折叠组成 ，其 中8个折叠组成一种 p 转化 TOP10感受态细胞保存 。大肠杆菌 (Esche— 折叠三明治夹心结构 ，另一个则游离在外 。其三级 richiacoli)BL21及原核表达载体 pET32a(十)由 结构 由3个B折叠反向排列成川字形 ，两个川字形 本实验室保存。试验动物昆明系小白鼠购 自石河 结构互相垂直排列成三级结构的主体部分 ，其余 B 子大学医学院实验动物中心。 折叠则处于连接位置上[2]。研究还发现，抗冻蛋 白 High—AffinityNi—NTA Agarose纯化试剂盒 的冰晶结合位点扁平 ，具有刚性侧链和骨架 ，能减 购 自 QIAGEN company；T4DNA 连 接 酶、Taq 少立体位阻，利于与冰晶形成多个氢键、范德华键 DNA 聚合酶、DNAMarker、蛋 白质 Marker、辣根 和盐键，有稳定 AFPⅢa一螺旋作用_3J