玉米大斑病菌钙调磷酸酶B亚基基因与克隆与功能分析.pdf

摘要 苏氨酸蛋白磷酸酶，在调控真菌生长发育及致病性方面起重要作用。本论文对玉米大 斑病菌钙调磷酸酶B亚基基因(calcineurinB，CnB)进行了克隆、生物信息学分析 和反义抑制表达分析，初步研究了钙调磷酸酶在玉米大斑病菌生长发育中的作用。 根据已知病原真菌CnB基因氨基酸序列保守区域设计简并引物，采用cDNA末 ofcDNA Ends，RACE)技术，首次在玉米大斑病 端快速扩增(RapidAmplification 菌中克隆得到了CnB基因全长eDNA序列(GenBank登录号：EF 序列。生物信息学分析表明，CnB基因含4个外显子和3个内含子，最大开放阅读框 为525 bp，编码174个氨基酸。蛋白保守结构域分析显示，CnB基因的预测蛋白含有 nodorum)、灰葡萄孢(Botrytis 病菌(Phaeosphaeria 三维结构发现，CnB空间结构由8个螺旋和4个折叠片组成，形成4个螺旋．环一螺旋 区域，这与CnB蛋白4个“EF．hand”保守结构功能域相吻合。 利用Genomic kb的DNA序列。分析 Walking技术获得CnB基因5’端上游约2 发现，该区域含有明显的启动子活性结构，但没有发现类似TATA盒的元件。存在光 测CnB基因可能在细胞形态建成及光信号传导通路中起作用；发现热激转录因子 (HSF)结合元件，推测CnB基因可能在真菌的耐热性和抗逆性方面发挥作用。以 病菌中以单拷贝形式存在。 在优化玉米大斑病菌原生质体制备和再生条件的基础上，基于pSOI质粒构建了 玉米大斑病菌CnB基因正义、反义表达载体。利用PEG介导的转化系统，通过转化 玉米大斑病菌原生质体获得23个阳性转化子。对继代培养后的阳性转化子进行PCR 验证，获得5个潮酶素磷酸转移酶基因插入的转化菌株。转化菌株菌丝细腻，菌落平 坦致密，其中两个转化菌株菌落生长速度缓慢。 关键词：玉米大斑病菌；钙调磷酸酶；基因克隆；反义抑制；功能分析 andFunctionaloftheCalcineurin Cloning Analysis in BGene turcica Setosphaeria Author．LIUYah-rod Supervisors：HANJian-min，DONGJin-gao Major．Botany Abstract Calcineufinis aconserved that all roleinthe of and protainphosphataseplaysimportant regulaticn morphogenesis invarious this wasclonedandidentifiedfrom pathogenesisfungi．Inwork,CnB gene studiedanddeducedits Setosphaeriaturcica，then rolesinturcica developmentby ofantise