若干大黄鱼性腺发育相关基因与克隆与表达.pdfVIP

若干大黄鱼性腺发育相关基因的克隆与表达 摘 要 以大黄鱼（Larimichthys crocea ）性腺为材料，采用SMART（switching mechanism at 5’end of RNA transcript ）技术和 DSN (duplex-specific nuclease ）处理构建了大黄鱼性腺线性化 cDNA 文库，并从文库中随机挑取了3961 个克隆进行测序，共获得3535 条高质量的表达 序列标签 （Expressed Sequence Tag，EST）。序列经聚类分析后共得到2916 条Unigene ，包 括415 条contigs 和2501 条singletons 。初步分析结果表明：该线性化文库的库容为4.3 × 6 10 pfu/mL ，文库重组率达95.8%，EST 的非冗余率为82.49%，Unigene 的平均长度为355 bp 。 经生物信息学分析，1785 个为已知基因占总ESTs 的61.21% ；其中与性腺发育相关的基因 66 个，占已知基因的3.70% 。微卫星分析发现共有129 条EST 序列含有149 个微卫星重复 序列，包括6 条与性腺发育相关的ESTs 。利用实时荧光定量PCR （qRT-PCR）技术分析了 11 个与性腺发育相关基因在大黄鱼性腺的表达情况。结果显示精巢特异性 LRR 基因 （testis-specific LRR ）只在大黄鱼精巢中表达 （P0.05 ）；雄性特异性致死 3 样 1 基因 （MSL3L1 ），雄激素相互作用受体核蛋白激酶基因（ARINPK ），精子发生凋亡相关蛋白基 因（SARP ），热休克蛋白70 （HSP70 ）和细胞周期蛋白A1 基因 （cyclin A1 ）在精巢中的表 达量高于卵巢 （P0.05 ）；相反，组织蛋白酶C 基因（Cathepsin C），核自身抗原精蛋白基 因（NASP ）和细胞周期蛋白B1 （cyclin B1 ）在卵巢中的表达量高于精巢 （P0.05 ）；促分 裂原激活蛋白激酶1 （MAPK1 ）和泛素C 末端水解酶L5 （UCH-L5 ）在精巢和卵巢中表达 没有显著差异（P0.05 ）。 在上述结果的基础上，利用SMART-RACE技术或RT-PCR技术克隆了大黄鱼性腺发育 相关基因cyp19a、cyp19b、cyclin B1 、CDC2、UBE2D和UBC9全长cDNA序列，其长度分别 为1805 bp、2268 bp 、1882 bp、1151 bp、798 bp和846 bp ，可分别编码518、500、397、303、 147和148个氨基酸的前体蛋白。利用qRT-PCR技术分析这些基因在大黄鱼各器官的表达情 况，结果显示：cyp19a在卵巢中的表达量显著高于精巢（P0.01 ），且cyp19a在精巢和卵巢 中的表达均极显著高于其它各器官 （P0.01 ）；cyp19b在端脑、中脑、下丘脑、脾和肝有较 高表达量，在雄性大黄鱼的血中表达量最高。在性腺表达量极低。cyclin B1 和CDC2基因在 性腺中的表达量极显著高于其它各器官（P0.01 ），且在卵巢中的表达量较精巢高（P0.05 ）。 UBE2D在脾脏和性腺中表达量较高，其它器官表达量较低，在性腺中的表达极显著高于其 它各器官（除脾脏外）（P0.01 ）。UBC9在性腺中表达量较高，且极显著高于其它各器官 （P0.01 ）。 关键词: 大黄鱼，EST，线性化cDNA 文库，性腺发育相关基因，qRT-PCR，RACE I Cloning and Expression Patterns of Gonad Related Genes from Large yellow croaker Abstract To clone the gonad-specific or gonad-related expressed genes of large yellow croaker Larimicht