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人微小病毒B19一VP2基因真核表达质粒的构建 硕士学位申请人 彭新 推荐导师 赵国强武峰 郑州大学基础医学院微生物与免疫学教研室(郑州450052) 摘要 Parvovirus 研究目的：人微小病毒B19(Human B19)系微小病毒属中唯--ti致人 类疾病的一种病原体，可引起传染性红斑、再障危象等多种人类疾病。目前尚未 建立针对该病毒的特异性疫苗，对人微小病毒B19感染的预防和治疗是急待解决 的问题。近年来国外开始把B19的衣壳蛋白作为疫苗抗原进行研究。本课题的目 基因片段重组其中，构建出pcDNA3．1一VP2重组表达载体，并将重组质粒免疫动 物，观察其免疫效应，以探讨人微小病毒B19一VP2基因作为基因疫苗的可行性， 为最终建立针对该病毒的特异性实用疫苗奠定基础。 方法：从人微小病毒B19的基因序列和结构分析中可获得B19一VP2的氨基酸序列， B19一VP2靶区域引物，为了克隆方便和插入方向正确，特意在两条引物上分别加 T7／SP6序列设计出引物对连接的正确性进行鉴定，利用AMP抗性对阳性克隆进 行筛选，并进行DNA测序，以保证克隆的目的片段的正确性；将重组质粒 II和BamHI酶切，电泳纯化后进行亚克隆， pGEM-T—VP2和pcDNA3．1同时用Hind 转化细菌，再次筛选和鉴定出阳性克隆，并进行DNA测序。大量培养、提取、纯 化pcDNA3．卜VP2，肌注家兔，动态采血，ELISA方法测特异性抗体。 结果： 1．表位分析：通过对VP2的294—541位氨基酸序列分析，初步确定了9个表位。 FKLGPRKATGRWN@)LYDPTATDAKQHHRHGYEK 2．靶基因扩增：以含有B19病毒全基因的质粒为模板，利用PCR扩增得到VP2 基因中的靶基因(4168—4968)，共800个碱基对。 3．克隆和亚克隆重组子结果鉴定：靶基因与pGEM-T质粒连接后，以T7／SP6作为 引物对转化后的质粒进行筛选扩增，得到960bp的阳性克隆，证实B19一VP2靶基 I酶切后进行亚克隆，以T7／SP6作为引物对转 pcDNA3．1同时用HindHl和BamH 化后的质粒进行扩增，得到966bp的阳性克隆。证实B19一VP2靶基因成功插入 pcDNA3．1，即得到pcDNA3．卜VP2重组质粒。 4．克隆和亚克隆重组子测序结果：对鉴定得到的克隆和亚克隆重组子 基因片段的碱基组成与公开发表的VP2序列完全一致，即成功构建pcDNA3．卜VP2 真核表达载体。 5．ELISA结果：实验动物的体内产生了高效价的抗B19病毒的IgG抗体。 结论：本课题利用分子生物学软件分析出B19～VP2抗原表位丰富区，确定了9 个抗原表位，主要集中于294-541位氨基酸序列中。利用分子生物学的方法，成 功构建含B19一VP2基因的真核表达质粒pcDNA3．卜VP2。并通过免疫接种，在动 物体内产生了较强的免疫应答。通过此项研究，为人微小病毒B19基因疫苗的研 制奠定了坚实的基础，并为进一步研究基于VP2的表位生物学和表位疫苗提供了 详实的数据。 关键词：人微小病毒B19；VP2：基因疫苗；真核表达 ConstructionofHuman ParvovirusB19-VP2 in ofPlasmid Eucaryotic gene Expression for Master Applicant Degree Pengxin