双基因转染骨髓基质干细胞促进人工骨血管化研究.pdfVIP

双基因转染骨髓基质干细胞促进 人工骨血管化的研究 段春光 孟国林 胡蕴玉 刘建 袁志 许彦明 李丹 吕昌伟 白建萍 毕龙 刘民 【摘要】 由于血供不足的原因，大段骨缺损的治疗非常困难。为了在骨缺损的修复过程中，促进新生血管的形成、提供充 足的血供，我们设计构建能够同时编码基因VEGF和Ang一1的腺病毒载体。腺病毒的构建参照经典的方法并加以优化，得到了 缺血皮瓣的存活。最后，将转染双基因的MSCs与优化改性后的快速成型人工骨材料PLGA复合。制成活性化人工骨。用于新西 兰大白兔桡骨大段骨缺损(1．5cm)的修复。结果显示双基因修饰的活性化人工骨对兔桡骨大段骨缺损有治疗作用。 【关键词】血管内皮生长因子；血管生成素；基因治疗；骨组织工程；大段骨缺损 大段的骨缺损一直是困扰临床医生的一个难 疗带来了新的希望。目前，使用骨组织工程的方法可 题，目前尚无有效的治疗办法。一般来讲，自体骨移 以在体外制造出具有活性的人工骨，但人工骨移植 植是治疗骨缺损的金标准。但由于缺乏足够的自体 到体内时，人工骨的成活依赖于体内血液的流注和 骨来源。自体骨移植应用在大段骨缺损的治疗受到 组织间液的浸润，而组织液最多只能浸润不超过 and 限制。随着骨组织工程的兴起，它给大段骨缺损的治 2001xm的范围fFolkmanHoehberg1973；Gold． steineta1．2001)。由于得不到充足的营养供应，大段 人工骨的成活受到限制。因而诱导人工骨的血管化 基金项目：国家自然科学基金资助项目 是解决这一问题的关键。 作者单位：710032西安。第四军医大学西京医院全军骨科研究所 在血管形成的过程中。许多细胞因子起了重要 (段春光、盂国林、胡蕴玉、刘建、裹志、李丹、吕昌伟、白建萍毕龙、 eta1． 刘民)；第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室(许彦明) 通信作者：刘建，Email：lj地ny@fhlmu．edu．cn 125 子。在本研究中。我们使用基因转染的方法为种子细 胞提供足量的与血管形成相关的细胞因子。由于腺 病毒具有高转染效率，且不整合人宿主基因组因而 安全性较好的特点，我们使用腺病毒作为基因转染 清的浓度根据细胞的生长速度从2％到10％不等。 的手段。在本研究中，我们制备了3种携带目的基因 重组质粒转染后5d。换液。从转染后3d始。使用平 的腺病毒，并使用这些制备的病毒转染MSCs，研究光显微镜及荧光显微镜下观察受转染的QBI一293A 转染后的MSCs是否能促进血管的形成，进而探讨细胞。当细胞的病理性变化(CPE)出现时，收集细 了使用双基因修饰的MSCs与人工材料复合、制备胞。反复冻融收集病毒。收集得到的初代病毒继续感 活性化人工骨。修复大段骨缺损的可行性。 染QBI一293A细胞。2—3天收集病毒。如此反复3 次。 材料与方法 四、细胞培养 一、质粒构建 常规分离培养MSCs，兔骨髓用DMEM冲洗。然 使用RT—PCR的方法克隆质粒pMD一18T— VEGF。具体方法如下：使用Trizol Reagent(Invitro． 后传代。传代时细胞密度约为2000cells／cm2。 gen)从人胎盘