TALEN技术敲除巴马小型猪GGTA1基因的研究.pdfVIP

萋糯纛黼黼黛黼蘸羹赫滋0麟麓圈●—黧黼谶簟—麓曩震鬻黑 论文集 丁ALEN技术敲除巴马小型猪GGTAl基因研究 李西睿，冯冲，龙川，王宁，潘登科+ 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193 引言 猪是人类异种器官移植理想的供体来源，但猪器官应用于人类器官移植面临着诸多难题，其中最为关 键的障碍是超急性免疫排斥反应(Hyperacute 起，人类的血清存在c【．Gal天然抗体，因此在进行异种移植时会产生HAR。克服HAR最直接有效的策略是 失活猪0【．1，3半乳糖苷转移酶基因(GGTAl)，但传统的同源重组基因打靶方法的打靶效率极低，纯合基因 敲除猪生产周期长。 白和FokI核酸内切酶共同构成的一类能在双链DNA上进行特异切割的嵌合分子，可在特定的DNA序列上产 生DNA双链断裂(double．strandbreak，DSB)，从而引发细胞自发性的修复，导致基因突变，基因沉默， 或介导靶基因的定点敲入。由于造价低廉、操作简便，现己成为了科研人员用于研究基因功能和潜在基因 治疗应用的重要工具。 材料与方法 方式转染到猪胎儿成纤维细胞内，细胞经传代培养后采用免疫磁珠筛选法去除细胞表面有0【一Gal的细胞，利 用有限稀释的方式将细胞稀释培养到lOOmm培养皿内(10cell／／1]1)，经过15d左右的培养，可获得单细胞 克隆。通过PCR和测序鉴定克隆点的基因敲除类型。以敲除细胞作为核供体，体外成熟的卵母细胞作为胞 质受体，进行体细胞核移植，胚胎培养1．2天后进行胚胎移植。 结果 基因敲除的细胞克隆为供体细胞进行核移植，将早期重构胚移植到5头受体猪中，最终3头受体妊娠到终 期，共产仔猪12头。通过PCR及测序验证全部为GGTA．／．双等位基因敲除猪。 验证基因敲除猪是否存在HAR采用细胞裂解反应，分别采用20％的正常人血清、胎牛血清及热灭活人 血清处理基因敲除仔猪耳成纤维细胞，以普通猪成纤维细胞作为对照组。结果表明，GGTAl敲除猪细胞能 够有效抵抗正常人血清中各种免疫成分的攻击，细胞死亡率与采用胎牛血清培养的细胞相当，这表明采用 TALEN技术有效的失活GGTAl基因，初步消除了HAR。 讨论 本研究利用TALEN技术成功获得了GGTAl基因敲除克隆猪。与常规的基因打靶技术相比，利用 TALEN技术介导的基因敲除效率在单细胞水平可以达到20％～26％之间，而常规同源重组的基因打靶效率仅 在10～～10‘。，效率提高了104～105，并且通过一次转染，可以实现一次性双等位基因的敲除，这在常规基因打 靶中是无法实现的，这样极大缩短了基因敲除纯合子的培育时间，为生产基因敲除动物提供了极大的便 利。另外，利用TALEN技术介导的基因敲除，无抗性标记，大大简化了生物安全评价过程。 致谢 150