波形蛋白在增生性瘢痕中表达与作用的研究.pdfVIP

波形蛋白在增生性瘢痕中表达与作用的研究 王珍祥昊军易绍萱等 第三军医大学附属西南医院整形外科(400038) 目的：波形蛋白是中等纤维的主要成分之一，在细胞骨架与运动中起着重要的作用。本 文探讨波形蛋白在增生性瘢痕中表达程度及对瘢痕增生与挛缩的作用。方法：收集病人不同 时期增生与非增生癜痕作为研究标本．利用基因芯片筛选出的差异基因，选择波形蛋白的基 因特异片段。制成寡核苷酸探针与瘢痕组织切片原位杂交，同时。将各标本进行组织块培养， 制成成纤维细胞爬片，进行原位杂交。结果：波形蛋白基因在3，6个月的增生性瘢痕中表达 均明显强于9，12个月增生瘢痕及非增生瘢痕，阳性细胞比例也高于9。12个月增生瘢痕及 非增生瘢痕。结论：瘢痕增生挛缩与细胞骨架运动的相关基因存在密切关系，而波形蛋白起 到关键的作用。同时，抑制该基因的表达，可能实现减轻瘢痕增生与挛缩。 刨面过度修复而出现增生性瘢痕挛缩，常破坏人体体表或内脏位置的均衡性，导致不同 程度的功能障碍。增生性瘢痕形成的分子生物学机制仍未深入了解，但与基因的变化有关。 马兵等利用基因芯片的方法，对烧伤后早期的增生性瘢痕相关基因表达变化进行筛选，发现 细胞凋亡、免疫相关、细胞骨架与运动、原(抑)癌基因、细胞信号等多种基因参与了增生 性瘢痕的发生。依此结果，笔者利用多种原位杂交技术。系统动态地研究波形蛋白基因表达 变化与瘢痕组织增生收缩之间相互关系，为发现治疗增生性瘢痕的新方法寻求理论依据， 材料与方法 2．I标本采集：所有病例均来自重庆市各医院，男女不限，年龄2．57岁，增生性瘢痕24 例，扁平瘢痕24例，按伤后3个月、6年月、9个月、12个月不同时间分组编号。所取标本 增生性瘢痕特点为早期外观发红充血、质硬、突出皮肤lcm以上，有典型的挛缩症状。扁平 瘢痕为突出皮肤不超过0．3cm．无收缩，另设正常皮肤对照12例。标本均在手术中均取，并 征得患者同意。 2．2试剂：武汉博士德公司提供，寡核苷酸探针特异性片段序列为： ATGGc 波形蛋白(Vimemin)5’—-TGTTGGTCGGCCAGCGAGAAGTcCA—CATCG A．r丌0GACATGCTGTTCCTGAATCT“GGCAGAOAAATcCTGCTCT CCTCG CCITC—0’。 u 2．3瘢痕组织切片原位杂交：操作按试剂盒提供的步骤进行．切片厚度20m，经4％多 聚甲醛固定。新鲜配制的O．5％的H202／甲醇灭活内源性过氧化物酶，胃蛋白酶消化暴露mRNA 核酸片段，预杂交液处理，寡核苷酸探针37℃杂交过夜，滴加封闭液，碱性磷酸酶标记的地 高辛抗体，生物素化过氧化物酶，3。3-二氮基联苯胺试剂盒显色，梯度酒精脱水．透明．中性 树胶封片．镜检。 2．4瘢痕成纤维细胞原位杂交：取瘢痕与正常皮肤组织．洗尽血迹．剪成i×1mm，走小 代。将经处理消毒的盖玻片置于直径10cm的培养皿内，滴加消化脱落的成纤维细胞继续培养 至90％融合。取出盖玻片，4％多聚甲醛固定45分钟，按上述原位杂交步骤反应显色。 2．5统计学处理：采用Mias图像分析系统采集数据，SPLM软件包行方差分析。 结 果 3．1阳性细胞分布及特点：寡核苷酸探针杂交阳性为细胞着紫黑色，着色越深，表明反应 越强烈。本实验中，早期瘢痕中波形蛋白基因的探针在组织细胞中有较强阳性的反应，而晚 期瘢痕则阳性反应较低，正常皮肤则更少。波形蛋白不仅在成纤维细胞中有阳性反应，而且 在血管壁内也存在阳性显色。另外，阳性成纤维细胞在早期为胞浆、胞核均强的着色，其后， 胞浆着色逐渐变淡，直至阴性，胞核仍可辨别。 3．2经对所有标本的观察，增生性瘢痕3-6个月波形蛋白的表达无论阳性细胞的数量， 反应的着色程度，明显强于9-12个月增生性瘢痕、非增生瘢痕与正常皮肤。将增生性瘢痕与 非增生瘢痕对比，两者差别特别显著(表1)。 表1 波形蛋白寡核苷酸探针在