多核白细胞弹性蛋白酶对人角膜基质细胞MMP1、MMP3表达的影响_临床医学论文.docVIP

多核白细胞弹性蛋白酶对人角膜基质细胞MMP、MMP表达的影响_临床医学论文 多核白细胞弹性蛋白酶对人角膜基质细胞MMP、MMP表达的影响_临床医学论文 作者：张冰洁 郝继龙 卢佳 吴雅臻 【摘要】 目的 探讨多核白细胞弹性蛋白酶与白细胞介素（IL）对人角膜基质细胞MMP、表达的影响。方法 体外培养人角膜基质细胞，在培养液中添加或不添加多核白细胞弹性蛋白酶或IL，培养5 d，通过免疫印迹分析法测定培养上清中的MMP、的表达。结果 在无任何刺激下人角膜基质细胞不表达MMP、添加IL后可诱导前体MMP、表达，而添加多核白细胞弹性蛋白酶不能诱导MMP、的表达；多核白细胞弹性蛋白酶可激活在IL诱导下产生的前体MMP、转化为活化形式的MMP、。结论 多核白细胞弹性蛋白酶和IL可协同诱导角膜基质细胞的胶原降解，诱发角膜溃疡的发生。 【关键词】 多核白细胞弹性蛋白酶；白细胞介素；角膜基质细胞；MMP；MMP 【Abstract】Objective To understand the mechanism of corneal ulceration by investigating the role of neutrophil elastase (NE)，interleukin (IL)（MMP）ter. The activity of MMP1 and 3 were examined by immunoblot analysis. Results Cultured human corneal fibroblasts didn′t release MMP1 and 3 without any stimulation. IL1α induced the expression of proMMP1 and 3, NE transformed proMMP1 and 3 into active forms induced by IL1α. Conclusions NE and IL1α can coinduce human corneal fibroblasts in collagen degradation. 【Key words】Neutrophil elastase; Interleukin 　　角膜基质细胞存在于规则排列的基质胶原纤维之间，对于维持角膜基质胶原代谢及自身稳定起着重要作用。角膜基质细胞可产生多种基质金属蛋白酶（MMPs）〔1〕，这些MMPs均以酶原的形式分泌到细胞外，在细胞外被激活后才具有酶解作用〔2〕，可裂解细胞外基质（ECM）、胶原等。如果MMPs过度表达，就会引起胶原过度降解，进而形成角膜溃疡〔1〕。而在角膜溃疡时角膜基质内可见大量的多核白细胞浸润，多核白细胞可以通过释放过氧化氢、自由基、弹性蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶和明胶酶等导致角膜病理性的组织损伤。本文利用免疫印迹分析的方法观察多核白细胞弹性蛋白酶在白细胞介素介导下对人角膜基质细胞MMP、3表达的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 人角膜基质细胞的分离培养及鉴定 　　人角膜取自于意外死亡的眼球捐献者，供体角膜中央部分用于穿透性角膜移植，残余周边部分用于本试验。按以前报告的方法〔3〕将供体角膜残余部分自角膜缘内1 mm剪开，去除角膜缘及巩膜部分，刮除角膜上皮及内皮，角膜基质以胶原酶消化，分离角膜基质细胞，原代培养于含10%胎牛血清 MEM 培养液中，传代培养4～5代的细胞用于实验。 　　1.2 人角膜基质细胞的鉴定 　　实验前倒置显微镜下观察角膜基质细胞形态，细胞的鉴定采用抗波形蛋白（Vimentin）抗体（非上皮细胞标志）、抗细胞角蛋白（Cytokeratin）抗体（上皮细胞表面标志）、抗α平滑肌抗体（SMA）（肌样成纤维细胞表面标志）行免疫染色〔4〕。 　　1.3 免疫印迹分析法检测MMP、的表达 　　将角膜基质细胞以0.25%胰酶消化后制成细胞悬液，稀释至约1×104 ml-1后置入6孔板培养至80%融合，换成不含有血清的MEM培养液培养1 d，使细胞达到同步化。添加或不添加多核白细胞弹性蛋白酶（30 nm，Sigma，美国）或IL（0.3 ng/ml，Genzyme，美国）的无血清MEM 培养液培养5 d。收集上清备用。配制10%十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酸胺凝胶，在4℃进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），过水洗净后转膜，NC膜作好记号后37℃封闭2 h，加入绵羊抗人 MMP、抗体室温下于摇床孵育2 h，以ECL试剂盒 (Amersham, Little Chalfont, UK)测定免疫复合物反应。 2 结 果 在无角膜基质细胞情况下，无论血清中是否添加多核白细胞弹性蛋白酶或IL均不能检测到MMP、的表达。人角膜基质