丙型肝炎病毒(HCV)的同步检测和基因治疗研究.pdfVIP

D．21 丙型肝炎病毒(HCV)的同步检测与基因治疗研究 孟祥贤王柯敏++李军郭秋平谭蔚泓李杜 刘选明唐志文刘凌凤 (湖南大学生物技术研究院，湖南大学化学化工学院， 湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室，长沙，410082) 反义核酸技术是一种新的基因治疗技术，己成为近几年来的研究热点．尤其是核酶的抗 病毒作用引起了研究者的广泛兴趣和关注㈣]．核酶(Ribozyme)是一类具有催化裂解活性的 小的RNA分子，当它与底物RNA分子形成特定的二级结构时，可在底物RNA分子的特定位 点形成特定的空间结构并发生切割反应，有效地封闭该RNA的表达。核酶酶切活性的测定， 是验证核酶设计合成正确与否及进行基因治疗的关键环节Ⅲ。目前大多采用同位素标记底 物后通过放射自显影的方法测定核酶体外切割活性，该法灵敏度高，但因同位素对人体健康 影响很大，来源也有限、操作及废物处理困难，同时RNA凝胶聚丙烯电泳操作复杂、烦琐 等缺点。限制了其广泛应用。 基于此．我们发展了一种无须放射性元素标记的、基于核酶和分子信标技术的疾病检 测与治疗同步进行的一种新的基因治疗方法。并以丙型肝炎病毒(Hcv)为研究对象进行了 一系列的研究。 利用Genebank文库，我们将HCV各个不同株系的基因组进行序列比较，找出了不同 病毒株系高度保守的基因序列，并计算机模拟分析其二级结构。据此我们设计了一种以丙 型肝炎病毒分子的5’UTR高度保守部位的一段序列为环状部位的分子信标探针(MB—Hcv) 及锤头型核酶(RZ)c“。我们利用能实时检测RZ酶切效果的船一Hcv分子，通过屏蔽物 对核酶活性的抑制和解屏蔽物对核酶酶切活性的恢复时荧光强度的所发身生的变化，对丙 型肝炎病毒分子实行了同步检测与切割。结果表明，针对丙型肝炎病毒分子设计的肺一HCV， 其信噪比为10：1，说明MB—HcV具有很高的检测灵敏度与特异性：在MB—HcV与RZ完全 反应后．然后依次再加入不同量的MB--HCV，荧光强度持续上升，证明此核酶具有强的持 续切割MB--HCV的能力。当我们在加入核酶的同时，加入核酶屏蔽物，荧光强度儿乎没有 增加，说明这种屏蔽物对核酶活性抑制能力很强：而当加入解屏蔽物时，荧光强度上升争 原有水平，核酶的酶切活性能全部恢复。因此可以得出结论，在反应体系中，不存在HCV hunu．eduCfl 通讯联系人：k姗angemail ．196． 靶序列时，核酶酶切活性始终被屏蔽物封闭，检测不到荧光的变化；当在反应体系中存在 HCV靶序列时，屏蔽物从核酶上掉下来，核酶恢复酶切活性，切割靶序列，发出荧光，通 过检测荧光强度的变化，实时检测核酶切割HCV靶序列的全过程，使检测和基因治疗HCV 同时进行． Tris— 同时，为研究核酶的最佳酶切活性，我们对参数进行了优化，结果表明lOOnM HCI(pH7．5)，20hM MRCl2为核酶发挥酶切活性的最佳缓冲液和金属离子浓度；温度对核酶 酶切活性的影响也非常大，在37℃时，核酶将她一HCV全部酶切需7小时。而在40C、其 他参数恒定时，核酶酶切相同数量MB-HCV只需2小时，核酶酶切活性提高了2．5倍，核酶 酶切话性的提高，使快速进行基因治疗也成为了可能· ／ √ 关键词：核酶 实时 同步检测和基因治疗， 、 、 × 参考文献 a1．Lancet，1995，12：345—347． EL，Brach姒et M．Esqoivel 1．Kiehntopf Res Tec8』．Antisense 2．KashaniM，FunaLT，Tone