端粒酶活性在人类鼻咽癌组织中表达地研究.pdfVIP

端粒酶活性在^类鼻咽癌组织中表达的研究 端粒酶活性在人类鼻咽癌组织中表达的研究 陈蔚蔚周宏远刘永惠张洁熊小熊 真核生物在进化的过程中形成了一种包含DNA和蛋白质的结构——端粒。在染色体末 端形成帽状结构，从而保护染色体不被降解和末端融合。由于末端复制问题的存在，随着细胞 的每一次分裂，端粒长度渐进性地缩短最终侵蚀到整个端粒及染色体的编码基因。当端粒长 度缩短到某一阈值时，细胞开始衰老死亡。肿瘤细胞之所以能无限繁殖，原因之一是因为肿瘤 细胞中具有端粒酶活性。端粒酶是一种核糖核酸蛋白酶，由RNA和蛋白质组成。端粒酶能 以自身的RNA为模板合成端粒重复序列，弥补细胞分裂时端粒长度的丢失。白K．皿等…1创 建了TRAP-PCR方法以来，已在很多肿瘤检测到了端粒酶活性。鼻咽癌是我国南方各省常见 的恶性肿瘤之一，早期诊断比较困难。我们检测了35例鼻咽活检组织中端粒酶的活性，其目 的在于探讨端粒酶作为鼻咽癌早期诊断与预后指标的可能性。 材料与方法 (一)标本来源 35例鼻咽活检组织来源于华西医科大学耳鼻咽喉科门诊未经任何治疗的患者。经病理 学诊断，鼻咽慢性炎症3例，异型增生4例，低分化癌28例，临床分期按1992年11月福州标 准。 f二)主要试剂 TelomeraseDetection DNA聚合 端粒酶检测试剂盒(TRAP-∞e Kit)购自OnconInc。Taq 双丙烯酰胺购自Sigma公司。 【三)端粒酶活性的检测 · 1．组织端粒酶活性的提取活检组织取样后1h内用PBS缓冲液冲洗去血液，置于液氮 中保存。因亚铁血红素为Taq酶的抑制剂【2I。每例取50～100mg冰冻组织，液氮碾磨，加 1×CHAPS lnnd／L Buffer[10Tris-HCl， PBS缓冲液，离心去上清，在沉淀中加200／_￡1 Lysis mmol／L mmol／L mmol／L mraol／LEGTA，0．1 PMSF，5 pH7．5，1 MgCl2，1 pME，0．5％ 000 min，4℃，16r／rain离心30min，取上清 CHAPS，10％Glycer01]重新悬浮，置于冰上孵育40 并分装，冻存于一80℃。酶的活性在次条件下可保存1年。每例提取液用考马斯亮兰测其蛋 白质浓度，以1mg／ml为标准反应浓度。 2．TRAP—PCR检测端粒酶活性因端粒酶自身含RNA，整个实验过程中应防止Rnase的 本课题受国家自然科学基金项目资助 作者单位：610041成都，华西医科大学附属第一医院肿瘤中心肿瘤研究所(陈蔚蔚周宏远张洁 熊小熊)；华西医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科(刘永惠) 310 中国癌症研究进展@ Buffer 抒染，所有的器皿均用DEPC处理。每例检测体积为50出[10×TRAP5．Opl，50× dNTPl．0pl，Isl．0m，TRAPprimermixl．0m，Taq酶2U，H20239．6一，组织提取液2．0mj min 反应液30℃延长30rain，然后按94℃30s，52℃40s，72℃140s，35次循环。 3．电泳及银染扩增产物在12．％非变性聚丙烯酰胺凝