猪TLR4基因变异位点分析.pdfVIP

分子系统学、进化与资源评价 猪TLR4基因的变异位点分析 2’ 翟春媛1，杨秀芹1，李海涛1，李金铃1，刘娣h 1‘东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨150030：2．黑龙江省农业科学院，哈尔滨150086 关键词：猪；TLR4基因；PCR．SSCP 引言 的脂多糖激活TLR4介导的信号转导通路，诱导多种细胞因子的表达，激活免疫反应，清除病原体。TLR4基 因突变可影响其功能，因此，TLR4基因的多态性分析对于畜禽的免疫相关性状研究有重要的意义。猪TLR4 基因自被克隆、测序以来，研究者们就把猪TLR4作为疾病抗性的重要候选基因，研究其在呼吸系统、肠道 系统疾病及天然免疫反应中的作用，并得到了一些重要结果。为了进一步研究TLR4与疾病抗性／易感性的关 和多态性分析，探讨不同基因型在猪种间的分布规律，为下一步通过相关性分析揭示猪TLR4基因遗传变异与 免疫疾病的关系、确定分子标记提供基础。 材料方法 采集野猪、民猪、杜洛克、北京黑猪、长白猪和大白猪六个猪种的耳组织样，通过酚一氯仿法提取基因组 DNA。设计4对引物，每对引物随机选取4头民猪的基因组来克隆全长外显子3并测序。对寻找到的3个错 义突变，利用PCR．SSCP方法进行多态性柃测，将PCR产物与适量的上样缓冲液混匀，98℃变性10min后， 迅速冰浴10min，上样于非变性聚丙烯酰胺凝胶，凝胶的浓度根据扩增片段的长度和单链结构不同而有所差 异，4℃电泳适当时间后，进行银染显色。每对引物随机选取不同基因型纯合片段进行克隆、测序，验证电泳 分犁结果。 结果与分析 T503C、T61 1、960、962、1027 改变。PCR—SSCP分析表明61 bp处的优势核苷酸分别为T、G、G、C。f独立性检验表明 在所检测的各多态位点，不同基因型在野猪、民猪、杜洛克、北京黑猪、长白猪和大白猪等6个品种间的分布 都存在着极显著的差异(P0．01)。 讨论 利用smart软件进行功能位点分析后发现本研究所检测到的所有突变都位于胞外区，在TIR结构域内未发 的碳末端基序 )结构域内。LRR负责识别 氨酸重复序列)结构域内，而第608位氨基酸位于LRRCT( 入侵病原体表面的PAMPs，这些点突变町能会影响宿主对病原体的识别，进而影响机体的免疫反应。168、204、 而在TIR结构域内未发现点突变。PCR—SSCP检测发现960bp和962bp处突变为紧密连锁(GCG／ACA)。 可能会影响TLR4的LRR区识别病原体表面的PRMPs及与协同分子女flCDl4分子中的亮氨酸重复序列 为低度多态，而野猪、民猪和北京黑猪为中度多态；T13引物除野猪、杜洛克为中度多态外，其它四个品种 均为低度多态。3对多态性引物所检测到的不同基因型的分布在6个猪种之间的差别不大。 致谢 (2008BADB2802)资助。丰通讯作者：刘娣，E—mail：liudil963@163．corn ～83—