生物功能化色谱方法研究转铁蛋白与其受体间的相互作用.pdfVIP

B22生物功能化色谱方法研究转铁蛋白及其受体间的 相互作用 马文…郭琼1屈锋1黄启斌2邓玉林1· 1．北京理工大学生命科学与技术学院，2．防化研究院第四所 蛋白质问的相互作用在生物过程中占有极其重要的地位。研究蛋白质问相互作用的方法 有很多，但各有其优缺点…。生物功能化色谱(biofunetional 法是发展出的在色谱体系下模拟出生物膜表面的环境进行膜上生物分子间相互作用研究的方 法，不仅可以研究蛋白间的相互作用，还可以进行药物吸收、药物筛选等一系列工作Ⅲ。转铁 到所有组织中。载铁转运蛋白通过与细胞表面的转铁蛋白受体结合内吞而将铁转运到组织细 胞中‘”。我们利用BFC方法在固定化人工膜表面研究转铁蛋白及其受体间的相互作用。 使用的色谱系统基于Trisep 公司。受体固定化过程“5是将0．2胁滤膜过滤后的膜蛋白提取液，加在2ml的样品环上，以 品为非膜蛋白BSA和2“MFc“样品。作用力的大小可以通过系统的前沿分析法来测量。 讨论： 1 Fc“的紫外吸收对测定的影响 由于Fe3+在278nm的条件下有吸收，对 转铁蛋白的测定造成干扰，因此需要将Fc“ 的浓度降低以将TF与Fe“混合，因此需要 排除Fe“对测定可能的干扰，在的浓度降到 图I：2mM和2uM的F七3+以及1．74ug(o．218nM)的TF的紫 2VM后，既保证了与转铁蛋白结合有足够量外吸收对比缓冲体系为古2RoL／LHgc】zlO皿ol／LNaCl的 50嘣ol几Tris-HCl．pH值为7 4，检测波长278nm． Fe“，又使Fe“的吸收不至于对转铁蛋白的 测定产生干扰。 2．流动相组分的选择 通常我们在构建生物环境时在流动相中加入一定量的EDTA以抑制金属对蛋白的影响， 在本试验中，EDTA的加入很有可能使与TF结合的Fe“脱离开蛋白，而失去其应有的功能， 因此在流动相中去掉了EDTA，防止其与Fe“络合。 3． 固定化蛋白前后配体的保留时间对比 将膜蛋白溶液固定化到IAM柱上的量可以通过测定过柱前后蛋白浓度的变化来确定，在 lmg固定化的蛋白中含的转铁蛋白受体是pM级的。对比固定化前后几种配体保留时间的变 化，可以看出内标BSA和TF的保留基本上没 有变化，只有结合了Fe“的TF的保留时间加长， 证明受体溶液中有物质固定到IAM担体上并与 TF发生了作用。 4．柱子的再生 通过增加缓冲液中NaCI的浓度和有机溶剂 的浓度可以将固定化的蛋白除去，从而恢复IAM 的性质。 结论：利用生物功能化色谱方法可以用来 研究转铁蛋白及其受体间的相互作用。在色谱环 境下模拟二者结合的条件，可以看出IT结合了 Fe3+后，与固定化在IAM柱上的转铁蛋白受体 围2：固定化置自前后配件保留时问的对比。缓冲体系为音 提取液有相互作用，通过比对初步断定是与转铁 2mm011Lugclz的50mol／LTris-HCl．pII值为L4，检测波 长278rm。 蛋白受体的相互作用，但其作用的大小以及特异 性，还需要竞争配体结合等试验来进一步验证。 此外，研究中还存在蛋白固定化的重复性和 活性保持方面的问题需要进一步实验来解决。 参考瓷辩： 1． 【美IE．Golmis编著，赁福初，饯晓红等译，蛋白质-蛋白质相互作用2004 2．邓玉彬刘艳清．马文，厉红．生物功能化色谱新概念厦其方法学研觅生命科学仪器．2004；5(2)：9--11 3．隋森芳犏著膜分子生物学高等教育出版社．2003 4 B10c聊sTRY Yanxiao撕岛1cmgraanXiao．ctal，，ANALYlm264，22-25(1998) Wainer．●804(2004)295-302 5．№岫Ma由瑙Du，RuthHsuesh，IrvingW