参附注射液对脓毒症大鼠心肌氧化应激与线粒体呼吸功能的影响.pdfVIP

参附注射液对脓毒症大鼠心肌氧化应激和 线粒体呼吸功能的影响 江荣林雷澍蔡莉娟王灵聪智屹惠吴艳春黄立权朱美飞 浙江中医药大学附属第一医院重症医学科 l实验材料与方法 1．1实验材料 1．1．1药品参附注射液(主要成分：红参、黑附片提取物)由四川雅安三九药 业有限公司生产，批号为国药准字Z2004-3117，规格为50ml／瓶。3％戊巴比妥钠 由浙江大学实验中心配置。MDA、SOD、考马斯亮蓝试剂盒由南京建成生物工程研 究所提供。其他试剂均为国产分析纯。 物中心提供。所有动物均自由觅食和觅水。 SBD50型)，紫外分光光度计(上海生化仪器厂)，MedLab生物信号采集处理系统 (南京美易科技有限公司)。 1．2实验方法 1．2．1实验分组与给药取雄性SD大鼠80只，采用盲肠结扎穿孔(cecal l ionand igat punctures，CLP)法制备重度脓毒症休克模型，随机分为假手术组， 脓毒症组，参附注射液低、高剂量组共4组，每组各20只。假手术组(Sham)： 仅行开腹手术，但不结扎穿孔盲肠。脓毒症组(CLP)：开腹手术后结扎穿孔盲肠， 经股静脉微量泵推注生理盐水(10ml／kg体重)。高浓度参附注射液组 min，给予参附注射液股静脉微量泵 (High-Shenfu，HSF)：大鼠行CLP手术后10 推注(10 但经股静脉注入的为参附注射液5ml／kg体重+生理盐水5ml／kg体重的稀释液。 记录手术后6、18h各组的相关指标。 1．2．2实验指标检测(1)大鼠血压的记录和左室功能评价大鼠用3％戊巴比妥 钠30mg／kg腹腔麻醉，行股动脉插管，通过压力传感器连接于MedLab生物信号采 集处理系统，记录MAP。行左心室插管，通过MedLab生物信号采集处理系统记录 end ventricular 左室收缩曲线；并记录心电图。计算左室舒张末压(1eft diastolic ventricular pressure，LVEDP)、左室发展压(1eftdeveloped 和HR等指标。 transferase— (2)凋亡的检测用TUNEL(Terminaldeoxynucleotidyl mediateddUTP 甲醛固定，，常规脱水，石蜡包埋，切片。将组织切片用二甲苯脱蜡，梯度酒精水 Buffered Saline) 化，37C下用蛋白酶K处理30rain后再用PBS(Phosphate 冲洗；0．3％H202甲醇溶液室温下孵育30min，PBS冲洗后加入荧光标记的核苷 酸和脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)的混和液，37℃水浴箱中反应60min，PBS冲洗； ．(避光)，苏木素复染后脱水，透明，封片。在高倍镜下(10目镜×40物镜)检 测，凋亡阳性细胞核呈棕黄色，凋亡阴性细胞核呈蓝色。以凋亡阳性细胞数目占 总细胞数目的百分比作为细胞凋亡指数(ApoptosisIndex，AI)。 (3)心肌组织MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸法测定。取10％左心室匀浆 上清液，依次加入试剂盒中的试剂，旋涡混匀器混匀，置沸水浴40min，离心取 上清液，蒸馏水调零，于532nm处测OD(opticaldensity)值。用考马斯亮蓝 法测定组织的蛋白含量，计算各组大鼠心脏MDA的含量。 (4)心肌组织SOD活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法测定。实验结束时取左心 室。用pH7．4磷酸盐缓冲液在冰浴下制成10％组织匀浆液，离心取上清液备用。 根据厂家说明书操作后，读取440hm下各组吸光度。用考马斯亮蓝法测定组织的 蛋白含量。