不同剂量猪繁殖和呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗肌肉注射诱导小鼠细胞免疫研究.pdfVIP

猪传染病 不同剂量猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5基因疫苗肌肉注射诱导小鼠细胞免疫的研究 (1．四川农业大学动物科技学院，四川雅安，625014；2．动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川雅 (Po．01)，CD8+T淋巴细胞在免疫后28天高于对照组，大剂量基因疫苗免疫小鼠的细胞免疫应答高于 答，并表现～定的剂量依赖性。 关键词：猪繁殖与呼综合征病毒ORF5基因疫苗；细胞免疫；小鼠 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine and ReproductiveRespiratory 例病例后，1990年在欧洲相继报道，在欧美各国的猪群中引发了一场空前的“流产风暴”，使有关国家的养 swinedisease，MSD)、“蓝耳病” 猪业蒙受了灾难性的经济损失。这种曾被人称为“猪神秘病”(mystery (Blue．eareddisease ofpigs)的新猪病，近年来已蔓延至亚太国家和地区，是目前世界范围内造成养猪业 经济损失的严重疾病之一。由于空气传播、持续感染、亚临床感染、免疫抑制和继发感染等囚素，使PRRS 的防疫工作面临困难。基因工程疫苗和基因疫苗的出现给PRRS的防治带米了新的希望。基因疫苗(Nucleic Acidvaccine)由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成，进入机体的基因疫 苗不与宿主染色体整合，但它能够表达蛋白，进而诱发各种免疫应答包括体液免疫应答和细胞免疫应答。 与常规基因重组疫苗相比，基因疫苗具有易于构建和制备、稳定性高等特点，能通过不同途径诱导机体产 小鼠后，探讨其细胞免疫发生规律，为PRRSV基因疫苗的临床应用提供科学依据。 ．1材料和方法 1．1材料 因，ORF5编码的GP5蛋白是病毒的糖基化囊膜蛋白，是PRRSV最重要的免疫原蛋白。由本试验室制备。 1．1．2 实验小鼠 四川大学实验动物中心)。 1．1．3主要试剂培养基RPMll640(GIBCOBRL公司产品)，按说明书用双蒸水配制，过滤除菌，临用 限公司产品)，FITC标记抗小鼠CD4+、CD8+单克隆抗体(批号：119451，Bio Legend公司产品)。 CellSorter，FACS，ELITE 1．1．4主要仪器流式细胞仪(FluoresecenceActivatedESP，Coulter公司)： 台式水平离心机(BECKMANCOULTERTM公司，美国)。 226 第六次全国会员代表大会暨第11次学术研讨会 1．2方法 1．2．1基因疫苗的免疫 200pg／只； lOOpg／只；C组肌肉注射pcDNA—PRRSV-ORF550I_tg／只；D组肌肉注 B组肌肉注射pcDNA-PRRSV-ORF5 射空载体质粒pcDNA200pg／R：E组肌肉注射PBS200pl／只为对照。上述各组均分别免疫2次，间隔15 进行预处理，使肌肉处于再生状态。以提高DNA的摄取率，3天后在相同部位进行DNA免疫。 1．2．2血样的采集 在第一次免疫后第7、15、28、41、55、70天各时间段从各组随机取3只小鼠用摘眼球法取抗凝血两份， 分别用于分离淋巴细胞作淋巴细胞转化实验和分析T细胞亚群CD4+、CD8+数量变化关系。 1．2．3淋巴细胞转化实验 1．2．3．1外周血淋巴细胞的分离 7个／ml，制成单细胞悬液。 Hepes20mmol／L)，将细胞稀释成lxl0 再继续作用2小时。 9．0进行统计学处理，计算其平均值。 1．2．4T淋巴细胞亚类数量的检测 离心10分钟，弃上清液，加5mlPBS，混悬，1500r／min离心10分钟，重复2次。 1．2．4．2 5分钟，离心力2009，弃上清，将管底细胞用lmlPBS悬浮，测样。 1．2．4．3