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科学技术 云南文山竹丛枝病的检测及15SrDNA片段序列分析 骆帝谕 王连春 (玉溪师范学院资源与环境学院，云南 玉溪 653103) 摘 要：用植原体16SrRNA基因通用引物P1／P7和RI6F2n／RI6R2，对表现丛枝的竹子植株总DNA进行直接PCRJg~巢式PcR扩增，得到长I．2kb的 目的 片段。经过克隆测序 比较分析，结果表 明其)~ 16SrI—B亚组。 关键词 ：云南；竹丛枝；16srDNA 竹是禾本科竹亚科Bambusoideae植物的总称。竹子是具有极高的 司，DNAMarker、Taq酶、Amp、IPTG等试剂购 自北京金式金生物科技有 观赏性的一种经济作物，其形态优美，常作为景观观赏、道旁植被、 限公司。pMD19一T购 自宝生物TaKaRa。 公园植物 [1]。云南文山州地处云贵高原东南部，属于亚热带气候，该 1．2材料总DNA提取 地区水热资源较丰富，年温差小，日温差大，比较适合竹子的生长 。 取材料O．5g，剪碎放于研钵中，加入液氮，研磨3—5次，直至成细 竹丛枝病又名 “扫帚病”， “竹簇叶病”，在韩国、印度以及中 粉状。参照植物基因组DM提取试剂盒的方法，提取植株总DNA干燥后 国许多省市均有报道[2—4]。感病植株生长势弱，出笋减少，严重的病 溶于EBbuffer溶液，于一20。c下冷冻保存备用。 竹常常会枯死，竹材质量严重下降。随着竹林面积迅速扩大，该病的 1．3PeR扩增 危害越来越严重，己成为竹子上最常见的严重病害之一 [1，5]。早期的 选用植原体16Sr1)NA通常用的引物Pl／P7和R16F2n／R16R2进行巢式 研究认为竹丛枝病是有瘤座菌[AciculosporiumtakeMiyake，Balansia PER扩增：25uL体系，10XEasyTaqBuffer2．5uL ，dNTP2uL， take(Miyake)Rlara]真菌引起的病害 [6]。然而许多植物丛枝病均被 引物各0．5HL，EasyTaqPolymerase0．25uL，DNA模板1uL。PCR 证实由植原体引起，随着分子生物学研究技术的进步，通过PCR扩增可 反应程序：预变性94~C 5min，变性温度94。C Imin，复性温度48。C 以快速鉴定植物材料中是否含有病原，本研究采拟采用PcR技术对文山 lmin，延伸温度72。C2min，总共30次循环，总延~*lOmin。巢式扩 表现丛枝症状的竹子植株进行植原体分子检测，并对扩增得到的16S 增程序为：预变性94~C 5min，变性温度94。C imin，复性温度55。C rDNA片段进行克隆及测序，并与已知的竹丛枝植原体16SrDNA进行序 imin，延伸温度72。Cimin30S，总共35次循环。扩增产物在1％琼脂 列同源性比较，确定其植原体株系的分类地位，并初步比较其各株系 糖1XTAE缓冲系统中电泳，每#LDn样3uL，用凝胶成像系统观察并拍照 间的差别。 记录 。 1材料与方法 1．4PCR扩增产物的纯化、克隆、酶切鉴定 以及序列测定 1．