颗粒溶素酶联免疫吸附测定法的建立及临床初步应用.pdfVIP

颗粒溶素酶联免疫吸附测定法的建立及临床初步应用 钱垮 陈孙孝 吴传勇 蒋廷旺 王燕 周晔 陈燕 陈波 邓安梅 仲人前 颗粒溶素 (granulysin，GNLY)是脂结合蛋白一皂素样蛋 提供，兔抗人GNLY多抗由本室 自制 (效价 1：6000)，辣根过 白(saposin．1ikeprotein，SAPLIP)家族成员之一 ，具有广谱细 氧化酶(HRP)标记的羊抗兔 IsG(Semtec公司)，牛血清 白蛋 胞毒活性，在抗感染和抗肿瘤免疫中发挥重要作用 。。因 白(BSA，华美生物工程公司)，DAB(3，3．2．氨基联苯胺盐酸 此，对GNLY血清表达水平准确定量具有重要意义。本 中心 盐，Sigma公司)。550型MicroplateReader酶联免疫检测仪 建立GNLY血清水平酶联免疫吸附测定 (ELISA)法，并检测 (Bio．Rad公司)。 30名正常人及30例传染性单核细胞增多症 (IM)患者血清 3．GNLYELISA法的建立 ：用 10mmol／LPBS(pH7．4， GNLY水平，以进行不同疾病期比较分析 ，并探讨 GNLY在 1％BSA)将 鼠抗人GNLY单抗体稀释成3 ml溶液，包被 感染性疾病诊断和临床实时监测中的应用价值。 96孔板，4℃过夜；含 1％ BSA的 10mmol／LPBS(pH7．4)， 一 、对象和方法 4℃封闭过夜 ；0．02％ 吐温 20PBS洗板 3次。然后分别加 1．对象：2001年 10月至2005年5月间本院住院和门 0．5、1、5、10、30、50rig／ml6种不同浓度的GNLY标准品、正 诊急性期 IM患者30例，男 16例 ，女 14例，年龄 18～41岁， 常人和患者血清 100 l至相应孔 (每份标准品及待测样本 均符合 IM诊断标准 ：(1)临床表现为发热 、咽峡炎、肝脾 均做复孔)，置 37℃孵育3h后 ，洗板5次。每孔分别加5O 淋巴结肿大，伴皮疹或和肝功能损害；(2)外周血 中异型淋 l兔抗人 GNLY多抗 (0．25 m1)和羊抗兔 IgG(HRP标 巴细胞10％；(3)血清嗜异凝集反应 阳性 (1：56)；(4) 记)，置 37~C孵育 1h后 ，加 DAB／H2O2于 37~C避光显色 20 EBV抗体 (EBV—IgM)阳性具备 (1)及其他3项中任何一项， min，最后加2mol／LH：SO终止反应。空白孔调零，酶标仪 即确诊。2005年 1月至 6月本院门诊健康献血员30名 ，男 450nm处读取吸光度 ( )值，30份正常健康人平均吸光 女各 15名，年龄 2O～67岁。各组年龄、性别构成差异均无 度值的临界值为A 。绘制标准曲线 ，计算待测样本中血清 统计学意义(P0．05)。采血分离血清，一20~C保存待测。 GNLY浓度。 2．试剂和仪器 ：重组人GNLY标准品(相对蛋 白分子质 4．重复性 试验：用 ELISA法分别 同批 测定 高 (35．7 量 9000)和鼠抗人GNLY单抗 (DH4)均 由美国斯坦福大学 rig／m1)、中(10．6rig／m1)、低 (2．8rig／m1)3种 GNLY浓度的 血清标本 10次，计算平均批 内变异系数 (CV)；同样 3份标 本每天测定 1次，连续测定6d，计算平均批间CV。 基金项 目：国家 自然科学基金资助项 目；上海市重 大科技攻关基金资助项 目(40DZ19116)；上海市重点科研支撑条件 5．阻断性试验 ：将已知浓度 (10．6rig／m1)的患者血清 项 目(051409012)；上海市重点基础研究项 目(05JC14052)；上海市 与1txg抗 GNLY单克隆抗体等体积混合，37~C作用 1h，4℃ 青年科技启明星计划资助项 目(QMXO1423) 过夜，次 日离心后，用本中心建立的EL1SA法测定上清液中 作者单位：200003上海，