半滑舌鳎线粒体DNA含量测定方法的建立与优化.pdfVIP

中国水产科学 2014年 9月，21(5)：920-928 JournalofFisherySciencesofChina 研究论文 DoI：10．3724／SP．J．1118．2014．00920 半滑舌鳎线粒体DNA含量测定方法的建立与优化 冯文荣 一，柳淑芳2，庄志猛2，马骞2，苏永全 ，唐启升 ，2 1．厦门大学 海洋与地球学院，福建 厦 门 361005； 2．山东省渔业资源与生态环境重点实验室，中国水产科学研究院 黄海水产研究所，山东 青岛 266071 摘要：本研究 旨在应用实时荧光定量PCR技术，建立半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)线粒体DNA(mtDNA)含量测 定方法并进行优化。通过质粒标准品的线性化处理、模板 DNA 的酶切和超声处理、mtDNA和核 DNA(nDNA)基 因引物的筛选实验，建立半滑舌鳎mtDNA含量测定方法 。结果表明，质粒标准品的构象对荧光定量PCR标准曲线 影响较大，线性化的质粒更适合用作标准品；酚．氯仿方法提取的模板DNA适用于 mtDNA含量测定，无需进行预 处理；用 D．1oop和ND1这 2对引物所得的拷贝数较小且结果一致，适用于mtDNA拷贝数的测定；以不同核基因 为参照所得的 mtDNA含量可能存在差异，当以单拷贝核基因ENC1和 MYH6为参照时，可以计算出单个细胞 中 mtDNA含量，若以多拷贝基因GAPDH为参照，mtDNA含量测定值则较小。采用本方法分别对半滑舌鳎肝 、肾、脾 和肌肉组织的mtDNA含量进行重复性检测实验，结果表明，相同组织的mtDNA含量显示出良好的重复性(尸O．05)， 而不同组织中mtDNA含量具有差异性，可见该方法稳定可靠，能为海洋鱼类mtDNA含量检测提供借鉴。 关键词：线粒体DNA含量；实时荧光定量PCR；半滑舌鳎；优化 中图分类号：$917 文献标志码：A 文章编号：1005—8737一(2014)05—0920—09 线粒体是细胞 内能量产生的主要场所，机体 的研究报道。 生命活动所需能量的80％以上来 自线粒体 J。线粒 半滑舌鳎fCynoglossussemilaevis)属鲽形 目 体DNA(mtDNA)是存在于线粒体内的长度17kb左 (Pleuronectiformes)，鳎亚 目(Soleoidei)，舌鳎科 右的环状双链 DNA，具有独立遗传能力，在细胞 (Cynoglossidae)，舌鳎属，为东北亚特有的名贵冷 中呈多拷贝，且在不同类型的组织细胞中以及不 温性海水鱼类，是中国重要的海水养殖对象[1。此 同发育阶段存在一定差异L2J。相关研究表明，线粒 外，雌雄半滑舌鳎的个体大小和生长速度差异悬 体能量代谢的改变与 mtDNA含量有着密切的联 殊，这一特殊发育模式为研究线粒体的能量代谢 系[3-5]o正常情况下，耗能高的组织细胞中mtDNA 及其相关的生物学过程提供了良好的实验材料。 含量较高，反之较低。还有研究表明，生物体的生 对半滑舌鳎不同组织 mtDNA 含量进行测定，有 殖细胞发生、个体发育、疾病和衰老等各方面均 助于揭示 mtDNA含量与组织细胞功能的相关性， 伴随着 mtDNA 拷贝数的变化 6【]，因此，检测 可以为研究 mtDNA在半滑舌鳎发育、生长等能 mtDNA含量变化，对于研究生物体的能量代谢和 量代谢过程中的生物学作用提供技术方法和理论 个体发育发生均具有重要意义。目前，人、牛、 依据。 鼠、斑马鱼、果蝇等模式动物的mtDNA含量已有 以往，mtDNA含量测定的方法有Southern杂交 研究报道9【训，但鲜有涉及海洋鱼类 mtDNA含量 和相对定量 PCR法等，这些方法存在组织消耗量 收稿 日期：2013．12．07；修订 日期 ：2014．03—11． 基金项 目：国家 自然科学基金项 目31201981)；国家国际科技合作专项项 目(2013DFA31410)． 作者简介：冯文荣(1986一)，女，博士研究生，从事渔业资源分子生态学研究．E-