共表达NEP1-40和PRP-1多顺反子重组scAAV的构建.pdfVIP

陕西医学杂志 2015年 3月第 44卷第 3期 263 共表达 NEP1—40和 PRP一1多顺反子重组 scAAV 的构建 西安交通大学医学院第一附属医院烧伤整形科 (西安 710061) 杨兴春 白转丽 王 瑞 柏宏亮▲ 摘 要 目的：构建共表达 NEP1—40和 PRP一1多顺反子重组双链腺相关病毒 (scAAV)。方 法：PCR扩增 NEP1—40、PRP一1及 FMDV2A 的 cDNA，建立 NEPI一40一FMDV 2A—PRP一1嵌合肽 eDNA。两端加入 Flag肽和 6×His肽后合成融合基 因eDNA，克隆到 PES载体构建 出重组质粒 PES／NEP1-40一FMDV 2A—PRP一1。双酶切 重组质粒 PBV220一NT4一NAP和 PES／NEP1—40一FM— DV 2A—PRP一1，连接 得到重组质粒 pBV220一NT4／NEP1—40一FMDV 2A—PRP一1。以腺相 关病毒 pSS—CMV构建双链腺相关病毒穿梭质粒 ssAAVpSSHG—NT4／NEP1—40一FMDV2A—PRP一1。经 细胞 内同源重组得到共表达 NEPI-40和 PRP一1的重组双链腺相关病毒 scAAV pSSHG—NT4／ NEP1—40一FMDV2A—PRP一1。测定病毒滴度并利用鸡胚背根神经节检测其生物活性。结果 ：克隆 了共表达 NEP1—40和 PRP一1的多顺反子融合基因eDNA，基 因测序及核苷酸序 列同源性 比较 结果 与设计序列一致 ；构建 了重组质粒 pBV220一NT4／NEP1—40一FMDV 2A—PRP一1，酶切鉴定、核酸序 列测定结果与理论值一致 ；重组 的双链腺相 关病毒 scAAV pSSHG—NT4／NEP1—40一FMDV 2A— PRP一1应用于鸡胚背根神经节显示明显促进神经突起生长。结论 ：成功构建 了共表达 NEP1—40和 PRP-1的重组双链腺相关病毒 scAAVpSSHG—NT4 ／NEP1—40一FMDV2A—PRP一1，并显示出促进 鸡胚背根神经节神经突起生长作用。 主题词 @富含脯氨酸多肽 @NEP1—40 1：2蹄疫病毒 @多顺反子载体 @ 自互补型腺相 关病毒 【中图分类号1 R392．3 【文献标识码】 A doi：10．3969／j．issn．1000—7377．2015．03．002 Construction 0fM ulticistronicscAAV containingtheFM DV 2A cleavage factorandco--expressingNEP1--40andPRP-1 Burn PlasticDepartmentoftheFirstAffiliatedHospita1ofMedica1Schoo1of Xi’anJiaotongUniversity(Xi’an700061) YangXingchun BaiZhuanli WangRui etal ABSTRACT Objective：ToconstructthemulticistronicscAAV containingtheFMDV 2A cleavagefactor andco—expressingNEP1—40andPRP一1．M ethods：PCR technologywasusedtoamplifytheNEP1—40，PRP一1and FMDV2A cDNA．ThechimericpeptidecDNA containingNEP1—40一FMDV 2A—PRP一1wassetup．Then thefusion geneeDNA wassynthetizedafteraddingtheFlagpeptidesand6×H ispeptidesatends．Therecombinantplasm id PES／NEP1—40一FMDV 2A—PRP一1wasconstructedbycloningthefusiongeneintothePESve